研究背景创面愈合的研究是医学界的一大课题。各种烧创伤引起的体表皮肤缺损不仅会造成局部的疼痛、渗出和感染,严重者还会导致水电解质紊乱、休克甚至死亡,即使愈合后也常会遗留瘢痕。如何加速创面的上皮化、尽早封闭创面是创面愈合治疗的目标和方向。表皮干细胞(Epidermal stem cells,ESCs)和成纤维细胞(Fibroblast,Fb)是创面愈合中最重要的细胞。ESCs是皮肤再生的种子细胞,它在创伤后能够增殖分化不断形成新的表皮细胞,从创缘或残留的皮岛向创面中心迁移以覆盖创面,因此成为促进创面修复的新靶点。但干细胞的移植可能带来一定的致瘤风险及免疫相容问题,而干细胞自身能分泌多种生长因子,因此更多研究者把目光转向了富含多种生长因子的干细胞培养基作为干细胞的替代治疗。Fb在创面形成后开始增殖并由创周向创面中心迁移、同时分泌胶原蛋白等细胞外基质,并与局部的新生血管和炎症细胞共同形成肉芽组织以填充创面、促进创面愈合,但在创面愈合后期Fb的过度增殖会导致病理性瘢痕的形成。神经生长因子受体P75NTR是神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)的低亲和力受体,是最早克隆发现的神经营养素受体,它具有多向性功能,P75NTR最终导致细胞存活还是凋亡,是由其共受体、衔接蛋白及其介导的信号通路决定的,现在已证实的共受体有Trk家族、Nogo受体和Sortilin。虽然P75NTR的主要功能是调节神经细胞的存活、死亡和神经元细胞间的信号传导,但P75NTR在非神经系统中的作用也受到越来越多的重视。近年来P75NTR作为干细胞Marker的研究越来越多,这也提示了 P75NTR与组织生长的密切关系。之前我们的实验已证实P75NTR在体外可以调控ESCs的功能,促进ESCs的增殖、迁移和分化,抑制ESCs的凋亡,并在体内促进创面的愈合。那么P75NTR是否能影响ESCs的分泌功能,这方面研究较少。我们分别构建了P75NTR过表达和P75NTR低表达的载体,发现P75NTR低表达载体与P75NTR正常表达载体中P75NTR的表达量无统计学差异,因此我们选取P75NTR过表达的ESC培养基P75NTRvoESC-CM来观察P75NTR对ESCs分泌功能的影响。Sortilin为P75NTR的辅助受体,与细胞凋亡密切相关。前期我们的研究已表明人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblasts,KFs)中Sortilin的表达低于人正常成纤维细胞(Normal skin fibroblasts,NFs)还进一步证明了 Sortilin过表达可以加速KFs的凋亡,这表明病理性瘢痕中Sortilin的低表达可能导致了 KFs的凋亡减少与胶原纤维的过度沉积,从而导致瘢痕的异常增生。创面愈合与瘢痕增生是连续性的过程,那么创面愈合过程中影响因素是否可以通过影响Sortilin来调节Fb的凋亡以及创面愈合的进程是我们关心的问题。本实验通过P75NIRvoESC-CM作用于体外培养的小鼠创面Fb来观察其中Sortilin的改变以探索P75NTRvoESC-CM对创面的影响是否能够通过ESCs分泌的生长因子来影响Fb中的sortilin从而发挥作用。目的分析P75NTR、ESC-CM、小鼠创面Fb和Sortilin之间的关联,探讨P75NTR在体外实验中对ESCs分泌功能的影响以及P75NTRvoESC-CM对小鼠创面的影响、对小鼠体外培养的创面Fb中Sortilin的影响为探索创面愈合的干预机制寻找新的方向。材料和方法1.小鼠 P75NTRvoESC-CM 的获取1.1小鼠ESCs的分离培养:使用Ⅳ型胶原快速黏附法和胰蛋白酶-EDTA消化法分离培养正常小鼠ESCs。通过倒置相差显微镜观察细胞形态、流式细胞术检测ESCs的特异性表面标志物整合素β1和细胞角蛋白19(Cytokeratin 19,CK19)、P75NTR以及角质细胞表面标志物细胞角蛋白10(Cytokeratin 10,CK10)来明确ESCs是否分离成功。1.2慢病毒转染ESCs实现ESCs中P75NTR的过表达:通过基因工程方法构建携带P75NTR的慢病毒,分别用携带P75NTR的慢病毒和空慢病毒转染2代(1X 104)ESCs。免疫荧光法检测带有绿色荧光的细胞来判断病毒转染细胞是否成功并粗略估计转染率,免疫细胞化学法和蛋白免疫印迹法检测ESCs表达P75NTR的数量以进一步明确转染情况。明确转染成功后分别设为P75NTR过表达组(P75NTRvoESCs)和 P75NTR 正常表达组(Control)。1.3 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)观察P75NTR过表达对ESCs分泌功能的影响:ELISA法检测ESC-CM中转化生长因子(Transforming growth factorβ1,TGFβ1)、表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量。2.P75NTRvoESC-CM对小鼠创面的影响2.1设计小鼠的皮肤全层缺失模型:每个小鼠后背各用直径1cm的活检穿孔器制作两处全层皮肤缺损模型。2.2分组及处理:所有小鼠随机分为3组,每组6只,在伤后第0、3d分别用P75NTR过表达的ESC-CM、P75NTR正常表达的ESC-CM、未培养ESCs的空培养基注射到创缘,作为实验组(P75NTRvoESC-CM)、阴性对照组(Control)、空白对照组(Vehicle)。2.3观测指标:在伤后0d、3d、7d拍照记录创面愈合情况并用透明膜描记法记录创面面积,最后计算未愈创面比率。然后在伤后第7d分别取每只小鼠两个创面包括创缘2mm的皮肤做HE染色观察组织学变化情况、Masson染色观察胶原变化情况。3.P75NTRvoESC-CM对体外培养的小鼠Fb中Sortilin表达的影响3.1伤后第7天取创面真皮组织分离Fb,用胰蛋白酶-EDTA消化法分离培养小鼠创面 Fb。并分别使用 DMEM、DMEM+Vehicle、DMEM+Control、DMEM+P75NTRvoESC-CM进行培养。通过倒置相差显微镜观察细胞形态、免疫荧光法检测Vimentin和Keratin来判断小鼠创面Fb是否分离成功。3.2 Western Blot检测四组不同培养基培养的Fb中sortlin表达的差异。3.3 CCK-8法检测在四组不同培养基中Fb存活能力的差异。4.统计学分析上述实验数据均使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。本实验中的数据均使用均数±标准差表示,两组之间的数据比较使用t检验,多组之间的数据比较使用ANOVA检验。*P<0.05和**P<0.01表示有统计学差异。结果1.小鼠 P75NTRvoESC-CM 的获取1.1采用胰蛋白酶-EDTA消化法和Ⅳ型胶原快速黏附法体外对ESCs进行分离培养,所得的细胞克隆能力强,在倒置相差显微镜下呈典型“铺路石样”克隆性增生。用流式细胞术检测到ESCs的特异性标志物整合素β1、CK19和P75NTR高表达,而角质细胞的特异性标志物CK10低表达,证明ESCs分离培养成功。1.2携带P75NTR的慢病毒和空慢病毒转染ESCs后,用免疫荧光法检测到带有绿色荧光的细胞,初步判断转染成功。免疫细胞化学和Western Blot进一步检测到携带P75NTR的慢病毒转染的ESCs表达更高水平的P75NTR(*P<0.05),表明携带P75NTR的慢病毒可有效转染ESCs,P75NTR过表达的稳定细胞株构建成功。1.3 ELISA检测到P75NTRvoESC-CM中TGFβ1、VEGF的含量要明显高于P75NTR正常表达组(**P<0.01),而EGF的含量要明显低于P75NTR正常表达组(*P<0.05)。2.P75NTRvoESC-CM对小鼠创面的影响2.1伤后Od、3d、7d创面情况大体观,可见伤后Od三组创面皆有少量渗液,无明显差别。伤后3d,三组创面皆有明显收缩,P75NTRvoESC-CM组收缩最明显、干燥无渗液,Control组次之,Vehicle组收缩最轻、且创面较潮湿。伤后7d,P75NTRvoESC-CM组基本痊愈,Vehicle组残余创面最大,Control组居中。用透明膜法计算伤后Od、3d和7d的未愈创面比率,P75NTRvoESC-CM组的未愈创面比率要明显低于Control组和Vehicle组(*P<0.05),而Control组的未愈创面比率要明显低于Vehicle组(*P<0.05)。2.2伤后7d HE染色可见P75NTRvoESC-CM组创缘表皮层明显增厚,表皮细胞向创面内迁移明显,迁移的细胞大多胞浆淡染、核仁明显,基底层细胞体积增大、排列疏松,呈现旺盛的增殖状态,真皮层血管化程度更高一些。Control组也有较多表皮基底细胞向创面迁移,但迁移细胞数量及表皮厚度均较P75NTRvoESC-CM组不明显(**P<0.01)。Vehicle组表皮增厚最不明显,且向创面中心迁移的细胞数最少,明显低于Control组(**P<0.01)。2.3伤后7d Masson染色观察胶原沉积情况,可见P75NTRvoESC-CM组肉芽组织中胶原阳性面积大、染色程度深、胶原粗大且排列紧密(**P<0.01)。Control组较P75NTRvoESC-CM组胶原染色程度稍浅、阳性面积较小、胶原排列较稀疏(**P<0.01)。Vehicle组较Control组胶原阳性面积小、染色浅、胶原细小且排列稀疏(**P<0.01)。3.P75NTRvoESC-CM对体外培养的小鼠创面Fb中Sortilin表达的影响3.1胰蛋白酶-EDTA分离培养小鼠创面Fb,所得的细胞克隆能力强,在倒置相差显微镜下呈典型的梭形,免疫荧光染色法检测Vimentin呈现绿色荧光、Keratin无荧光显影证明小鼠创面Fb分离培养成功。3.2 Western Blot检测四组不同培养基中小鼠创面Fb的Sortilin表达,结果发现DMEM组的Fb表达Sortilin最高,DMEM+Vehicle组略低,但与DMEM组无统计学差异(P>0.05),DMEM+Control组低于前两者(*P<0.05),最低的是DMEM+P75NTRvoESC-CM 组且明显低于DMEM+Control 组(*P<0.05)。3.3 CCK-8检测四组不同培养基中Fb的存活能力,结果发现DMEM+P75NTRvoESC-CM组中Fb的存活数量最多,明显高于其他组(*P<0.05),DMEM+Control组次之,且明显高于剩余两组(*P<0.05),存活数量最少的是DMEM+Vehicle组和DMEM组,两组无统计学差异(P>0.05)。结论1.P75NTR过表达表皮干细胞模型构建成功,P75NTR过表达在体外能够促进小鼠表皮干细胞分泌TGFβ1、VEGF并抑制其分泌EGF。2.与P75NTR正常表达的表皮干细胞条件培养基,P75NTRvoESC-CM更能提高小鼠全层缺损创面的愈合率、增加增殖期的表皮层厚度和胶原沉积,这表明P75NTRvoESC-CM在创伤愈合的增殖期可能通过表皮干细胞分泌的生长因子来促进成纤维细胞分泌更多的胶原来形成肉芽组织填充创面,进而加速创面的愈合。同时刺激表皮增厚,可能对愈后质量有所改善。3.P75NTRvoESC-CM可以抑制体外培养的小鼠创面成纤维细胞中Sortilin的表达、提高创面成纤维细胞的存活水平,这表明P75NTRvoESC-CM可能通过表皮干细胞所分泌的生长因子来达到这种效果,最终促进创面愈合。