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本研究选用 6 个花生栽培品种,研究了外植体类型、生理状态、基因型、培养基激素等因素对花生离体培养再生的影响,明确了器官发生途径、胚胎发生途径的技术条件和再生效率,建立了高效的花生叶片离体培养植株再生体系。首次发现了营养器官组织培养诱导开花现象,探讨了关键技术,提出了花生在试管内开花、自交、结实完成生活周期,加快育种进程的新途径。研究优化了农杆菌介导途径进行花生遗传转化的技术要素,建立了高效的遗传转化体系。利用这一体系,分别把抗真菌的γ-硫堇蛋白(Rs- afp1)基因和能提高维生素 E 活性的 γ-维生素 E 甲基转移酶(γ-tmt)基因导入花生栽培品种,获得转基因植株。通过对标记基因、报告基因的 PCR 检测,以及对目的基因的 PCR 检测、PCR-Southern-blotting 分析和 Southern-blotting 分析,证明这些基因已整合到花生基因组中。据此,提出了花生基因转化的优化途径和技术规程。取得的主要研究结果如下: 1、花生组织培养离体再生体系的研究 以花生胚小叶作为外植体用于组织培养离体再生和农杆菌介导的基因转化,具有取材简单,来源丰富,再生率高的优点。胚生长点作为外植体虽然取材数量受限制,但组培再生率、转化效率高。培养基中添加 BA 和 NAA 能有效诱导花生胚小叶以器官发生途径再生,以 MSB+4.0 mg/L BA+1 mg/L NAA 培养基的诱导效果最好。6 个花生品种中,丰花 2 号和鲁花 11 的再生能力最强。培养基中添加 2,4-D 能有效诱导花生胚小叶以胚胎发生途径再生,以 MSB+10 mg/L 2,4-D 培养基的诱导效果最好。在 MSB +1 mg/LBA+0.5 mg/L KIN+2 mg/L IAA 培养基中诱导的愈伤组织,转入含 MSB+1～2 mg/LBA 培养基中能诱导花器官再生,花器官转接到 MSB 培养基上能开花、成针、结实。 2、遗传转化影响因素的研究 研究表明:(1)MSB 培养基中附加 500 mg/L Cef 能有效抑制试验菌株 EHA105 和GV3101 的生长,而对花生外植体再生无显著影响。(2)附加 100 mg/L Kan,或 300mg/L新霉素,或 10mg/L G418 的 MSB 培养基,能有效抑制非转化愈伤组织或芽丛再生,用于组培阶段对 nptⅡ基因转化材料的筛选。nptⅡ基因转化材料的田间筛选,用 5 g/L Kan 1<WP=11>Rs-afp1基因和 γ-tmt 基因转化花生及高效遗传转化体系的研究溶液苗期涂抹花生未展开叶,非转化材料叶片失绿黄化。(3)农杆菌侵染时间(15min)一定时,菌液浓度对转化率影响较大,以 OD600=0.65 转化效果最好。(4)农杆菌感染后共培养时间为 4d 时转化效率较高。(5)种子不同萌发天数的幼叶与转化率密切相关,以萌发 6d 幼叶为受体转化效果最好。(6)预培养时间和预培养所用培养基对转化率有显著影响,胚小叶在诱导分化培养基 MSB+BA4.0mg/L+NAA1mg/L 上,预培养 4d 后,再侵染对转化有利。(7)同一基因型的不同受体类型,Rs-afp1 基因转化率存在明显差异,鲁花 11 再生芽丛的转化率最高(11.97%),其次是胚小叶(4.68%),种子萌发 6d幼叶最低(2.43%);丰花 2 号,以胚生长点的转化效率最高(3.25%),其次是胚小叶(2.95%),6d 幼叶最低(1.96%)。基因型不同,Rs-afp1 基因转化率也不同,种子萌发6d 幼叶作转化受体,转化率从高到低依次为鲁花 11、丰花 2 号、丰花 1 号。(8)γ-tmt基因转化花生的研究表明,鲁花 11 的转化率高于丰花 2 号,同一品种的胚生长点的转化率高于胚小叶的转化率。 3、Rs- afp1基因转入花生栽培品种 利用优化的基因转化体系,以鲁花 11,丰花 2 号,丰花 1 号三个花生品种为受体,分别选用预培养 4d 的胚小叶、种子萌发 6d 的幼叶、叶片再生的未伸长芽丛及胚生长点作为侵染外植体,经农杆菌 EHA105(PGV-RAG)侵染后,组培阶段 Kan 筛选获得 223株转基因植株,对其中的 29 株进行标记基因、报告基因的 PCR 检测,以及对目的基因的 PCR 检测、PCR-Southern-blotting 分析和 Southern-blotting 分析,证明这些基因已整合到花生基因组中。证实 22 株转基因花生植株的基因组中,有目的基因的整合,阳性率为 75.86%。 4、γ-tmt 基因转入花生主栽品种 利用优化的基因转化体系,以鲁花 11 和丰花 2 号两个花生品种为受体,分别选用预培养 4d 的胚小叶及胚生长点作为侵染外植体,经农杆菌 GV3101(PGBVE)侵染后,再生芽,经 PPT 筛选获得 14 株转基因植株,通过标记基因 PCR 检测,以及对目的基因的 PCR 检测、PCR-Southern-blotting 分析和 Southern-blotting 分析,证明这些基因已整合到花生基因组中,无假阳性植株。 5、农杆菌介导途径进行花生遗传转化的技术规程 大花生品种选用鲁花 11,小花生品种选用丰花 2 号,以成熟饱满种子的胚小叶和胚生长点作为转化受体,接种在 MSB+4.0mg/L BA+1.0mg/L NAA 培养基上预培养 4d 后,用过夜培养活化的农杆菌 EHA105(PGV-RAG)悬浮液(OD600=0.65)侵染 15min,共培 2<WP=12>山东农业大学博士学位论文养(4d)后,Cef (650mg/L)杀菌 6h,转接在含 500mg/L Cef 和 100mg/L Kan 的 MSB+4.0mg/LBA+1mg/L NAA 培养基上继续培养,每 20d 继代培养一次。筛选培养 40d 后,将存活的