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器官移植延长了许多患者的寿命,提高了他们的生活质量,但是供体器官短缺严重制约着器官移植的发展,异种器官移植是解决这一难题的好方法。目前许多实验室致力于异种移植实验,包括肺移植,他们大多以猪肺为供体,狒狒替代人类作为受体,但在移植过程中存在免疫排斥等问题。本研究希望获得一个肺缺陷的猪模型,用病人的iPSCs注射进猪囊胚中,补偿性的填补肺发育微环境,产生一个完全的病人iPSCs来源的肺。肺发育开始时,从胚胎原肠的上皮细胞中伸出两个肺芽,两个肺芽反复分支形成各级气管,这种分支发育模式称为分支形态发生。FGFR2的一个亚型FGFR2b参与调控肺芽上皮分支形态发生。为了在肺分支形态发生过程中阻断FGFR2b功能,影响肺发育而不影响其他胚胎组织。本试验用人源SFTPC启动子在转基因猪的肺泡上皮细胞中表达显性失活FGFR2c和FGFR2b,以及表达可溶性显性失活的FGFR2b-HFc,阻断气管分支和上皮分化,获得肺发育缺陷的转基因猪。研究目的通过阻断FGFR2b下游信号构建肺缺陷猪模型。研究方法1.设计和构建三种表达显性失活FGFR2的重组质粒,分别表达FGFR2c的胞外区和跨膜区(DNFGFR2c)和FGFR2b的胞外区和跨膜区(DNFGFR2b),以及表达FGFR2b胞外区和IgG的重链恒定区的重组蛋白(DNFGFR2b-HFc)。2.用细胞核转染法将构建好的DNFGFR2c、DNFGFR2b和)NFGFR2b-HFc重组质粒分别转染入猪原代成纤维细胞,经Puromycin筛选形成单细胞克隆,挑取细胞克隆并PCR鉴定。3.借助体细胞核移植方法,以转基因细胞作为体细胞核移植供体,以去核的卵母细胞为受体,经电融合形成囊胚,存活的囊胚移植到代孕母猪体内,怀孕母猪生出克隆猪。4.对获得的克隆小猪进行基因型和表型鉴定,用基因组PCR扩增方式进行基因型鉴定；基因芯片和RT-PCR方法检测nRNA水平表达；组织学观察肺发育情况；免疫组织化学检测肺间质和实质发育。实验结果应用体细胞核移植技术获得三种克隆猪,基因型鉴定显示所有克隆猪均为转基因阳性,肺组织mRNA检测也为阳性。DNFGFR2c受体猪怀孕4头,其中1头受体猪E43剖出3只发育正常胎儿。另外3头受体猪足日分娩出7头胎儿,其中4头死胎,2头出生后立即死亡,还有1头出生后一个月死亡。E43和新生DNFGFR2c转基因猪的肺均未表现为明显发育滞后,新生DNFGFR2c转基因猪的围产期死亡率高(6/7)。DNFGFR2b受体猪怀孕3头,1头受体猪E43剖出3只发育正常胎儿,1头受体猪E110剖出3头发育正常胎儿,另1头受体猪足日分娩出2头死胎。E43DNFGFR2b转基因猪,肺叶以间质较多,肺气管分支较少,E110 DNFGFR2b转基因猪肺泡偏大,肺泡隔薄,肺泡隔胶原纤维较少,肺发育稍微滞后。DNFGFR2b-HFc受体猪怀孕2头,1头怀孕受体猪E43剖出6只正常胎儿；另1头受体猪E110剖出6头发育正常胎儿。E43 DNFGFR2b-HFc转基因猪,肺叶以间质为主,实质少,肺气管分支较少,肺远端间皮下间质中未见细支气管。E110DNFGFR2b转基因猪肺体积小,肺泡结构不典型,肺泡小,肺泡隔较厚,肺泡隔中胶原纤维较多,肺发育严重滞后。结论肺上皮细胞过表达DNFGFR2c、DNFGFR2b和DNFGFR2b-HFc能够部分阻断FGFs和FGFR2b信号通路,猪肺发育缺陷,导致死胎现象。DNFGFR2c转基因猪肺发育稍微滞后于野生型猪；DNFGFR2b转基因猪肺泡偏大,肺泡隔薄,肺泡隔胶原纤维较少；DNFGFR2b-HFc转基因猪肺远小于野生型猪,实质区偏小,肺泡隔较厚,肺泡小,间质异常发育,肺间质和肺泡隔中胶原纤维远多于野生型。