淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,LAG3)是表达在T细胞表面的抑制性受体(Inhibitory receptor,IR)。T细胞表达多种IRs,如T淋巴细胞相关抗原4(T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein-1,PD-1)等,来避免由于免疫反应的失控导致的免疫细胞过度活化、调节免疫反应的持续时间和幅度、维持免疫耐受、避免组织损伤和自身免疫病的发生。但是IRs持续性的高表达,可抑制T细胞功能,导致T细胞的无应答,无法发挥免疫作用。靶向封闭IRs,使T细胞恢复活性已被证明可显著增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应,这些IRs也因此被称为免疫检查点(immune checkpoint)。目前,靶向性封闭CTLA-4、PD-1或其配体PD-L1的治疗手段已经应用于临床治疗多种肿瘤,这表明了阻断T细胞抑制性信号用于疾病治疗的可行性。但是仍有很多患者未从这些药物中获益,因此仍然需要更多靶向各种类型免疫检查点的研究。LAG3也是一种免疫检查点,当其与MHCⅡ结合时可直接抑制T细胞活化的第一信号,负性调控T细胞的功能。靶向封闭LAG3可通过抑制LAG3传导的抑制信号,显著增强T细胞活性,进而提高免疫反应。目前,尚未见到靶向LAG3的寡核苷酸类抑制物的报道。在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸,并探究了其维持T细胞反应的效应以及作为重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗佐剂的可能性。在探究靶向LAG3的反义寡核苷酸是否也能作为肿瘤疫苗佐剂增强抗肿瘤活性的研究中,我们意外的观察到了Lewis肺癌肿瘤裂解物引起的小鼠十二指肠致死性坏死,并探讨了此种坏死发生的可能原因。1.LAG3干扰反义寡核苷酸的设计与筛选为了设计靶向LAG3的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs),利用NCBI核苷酸数据库分别获得人和小鼠的LAG3 mRNA序列,并通过BLAST网站筛选出可用于设计ASOs的保守区。在对保守区序列进行特异性检测后,筛选出15个可用于设计ASOs的靶向区域。然后,设计出15个与这些靶向区域完全反向互补的ASOs,并利用“sfold”和“mfold”网站以结合位点的二级结构、结合自由能以及是否含有惰性序列作为筛选指标对这些序列进行评估。结果显示,有两个符合要求的LAG3干扰寡核苷酸(LAG3 interfering antisense oligonucleotides,LIOs),即LIO-1和LIO-2,可用于后续研究。2.LIO进入免疫细胞的情况分析为了探究LIO能否进入免疫细胞尤其是T细胞,将LIO-1和LIO-2分别标记了Cy3荧光信号后,采用流式细胞术观察了na?ve ICR小鼠淋巴结细胞和脾细胞中的总T细胞、CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、B细胞以及DC细胞对LIO-1及LIO-2的摄取情况。然后,利用免疫荧光技术进一步观察了LIO是否能定位于T细胞内部。结果显示,淋巴结细胞及脾细胞中的主要免疫细胞均可摄取LIO-1和LIO-2,并且LIO-1和LIO-2可定位于CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的内部。结果提示:LIO-1和LIO-2均可以进入T细胞内部。3.LIO对T细胞LAG3表达的抑制效应为了探究LIO-1和LIO-2是否可以抑制LAG3的表达,首先利用RT-PCR技术检测了LIO对脾细胞中LAG3 mRNA表达的影响,然后利用流式细胞术分别检测了LIO对脾和引流淋巴结中的T细胞以及人T细胞淋巴瘤细胞系(Jurkat)细胞LAG3蛋白表达的影响。结果显示:1)LIO-1可抑制脾细胞中LAG3 mRNA的表达,LIO-2无明显作用;2)LIO-1可降低脾和引流淋巴结中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞LAG3的表达,LIO-2无此效果;3)LIO-1可减少Jurkat细胞表面LAG3的表达,LIO-2仍然没有显著效果。由此可见,LIO-1可抑制LAG3的表达,但是LIO-2未能发挥抑制作用。4.在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响为了探究在recall反应中LIO对抗原特异性T细胞反应的影响,分离了LIO联合重组猪圆环病毒2b型(porcine circovirus type 2b,PCV2b)衣壳蛋白(CP)疫苗免疫的小鼠的脾细胞后,在体外使用CP蛋白再次刺激。然后利用T细胞增殖实验检测了抗原特异性CD4~+T和CD8~+T细胞的增殖情况。此外,还采用实时定量PCR技术检测了上述脾细胞在CP刺激后,细胞因子干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4和IL-6的mRNA表达情况。结果显示:1)LIO-1可以显著提高重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4~+T细胞的增殖比例,但对抗原特异性CD8~+T细胞的增殖比例无明显影响;2)LIO-1可显著提高脾细胞中IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表达水平。由此可见,在recall反应中,当再次暴露于抗原时,LIO-1可以促进重组蛋白疫苗诱导的抗原特异性CD4~+T细胞增殖以及细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生。5.LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响为了进一步探究在体内LIO对维持抗原特异性T细胞活化的影响,本研究在小鼠第二次免疫LIO联合重组CP蛋白疫苗48h后,利用流式细胞术检测了小鼠引流淋巴结和脾中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞表面T细胞早期活化标志CD69的表达情况。此外,本研究还利用实时定量PCR技术检测了上述引流淋巴结细胞和脾细胞中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 mRNA的表达水平。结果显示:1)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中CD4~+CD69~+T细胞的比例。2)LIO-1可提高重组蛋白疫苗诱导的引流淋巴结细胞中IFN-γ和IL-2的mRNA表达。由此可见,LIO-1在体内可维持引流淋巴结中CD4~+T细胞的活化,并可促进细胞因子IFN-γ和IL-2的产生。6.LIO对重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应的促进作用由于LIO-1可显著增强CD4~+T细胞反应,这提示其有可能可以促进重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。为了验证这一猜想,本研究使用间接ELISA技术检测了LIO-1联合重组CP蛋白疫苗或是联合灭活FM1流感病毒疫苗免疫小鼠时,诱导的抗体反应。结果显示:1)LIO-1可显著提高重组CP蛋白疫苗诱导的抗体水平;2)LIO-1可显著提高灭活FM1流感病毒疫苗诱导的抗体水平。由此可见,LIO-1可作为佐剂,增强重组蛋白疫苗和灭活病毒疫苗诱导的抗体反应。7.CD8~+T细胞和IFN-γ与小鼠十二指肠坏死的相关性观察在进一步探究LIO-1是否也能作为肿瘤疫苗佐剂时,我们意外的发现了Lewis肺癌肿瘤裂解物疫苗(LCLV)注射na?ve C57BL/6小鼠可引起广泛的十二指肠致死性坏死。为了探究这一现象发生的原因,na?ve小鼠注射LCLV后,在小鼠濒死时,利用流式细胞术分别检测了小鼠外周血白细胞(peripheral white blood cells,PWBC)、脾细胞及引流淋巴结细胞中CD4~+T细胞和CD8~+T的比例,并利用实时定量PCR技术检测了小鼠PWBC和脾细胞中IFN-γmRNA的表达情况。注射生理盐水的小鼠作为对照。结果显示:1)注射LCLV的小鼠PWBC中CD8~+T细胞比例增高了5倍,达到约50%。2)相比于正常小鼠,注射LCLV的小鼠PWBC中IFN-γ表达水平迅速提高了约12倍。这提示,小鼠外周血中显著的CD8~+T和IFN-γ产生的增高可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。综上所述,在本研究中,设计了靶向LAG3的反义寡核苷酸药物(LIO-1),并证明LIO-1能进入T细胞内部;可诱导LAG3 mRNA的降解;抑制CD4~+T细胞LAG3的表达;维持抗原特异性CD4~+T细胞的增殖;促进CD4~+T细胞的活化;促进细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的产生;增强重组蛋白疫苗和灭活流感病毒疫苗诱导的抗体反应。因此,LIO-1作为LAG3的核酸类抑制剂,可以增强微生物疫苗诱导的抗体反应,有成为一种新型佐剂的潜能。此外,在本研究中还意外发现了小鼠外周血中显著升高的CD8~+T细胞和IFN-γ产生可能与十二指肠致死性坏死存在相关性。这一发现,如果能被进一步证明,可能有助于在临床上通过检测外周血CD8~+T细胞和IFN-γ水平来提示患者发生十二指肠广泛坏死的风险和通过降低外周血CD8~+T细胞和IFN-γ水平防止十二指肠广泛坏死的发生。