谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合成的三肽,是细胞或组织内存在的重要的非蛋白类含硫物质。它具有非常重要的生理功能和临床应用价值。目前GSH最主要的生产方法是微生物发酵法,选用的菌株多为酵母。在传统的诱变育种之后,基因工程定向改造方法使用越来越广泛。毕赤酵母是使用非常广泛的真核蛋白表达体系,它作为表达宿主具有很多优势,如具有严密调控的高效启动子,可以高密度发酵,外源蛋白不会过度糖基化等。本论文通过在毕赤酵母中以GAP启动子高效表达来自酿酒酵母的GSH合成酶基因sGSHl和sGSH2,构建毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌。因胞内GSH的过量积累会造成GSH合成酶Gsh1p受到反馈抑制,从而导致酶活性减低,不能有效提高谷胱甘肽的产量。基于此,本论文在已有的酿酒酵母谷胱甘肽转运体系研究的基础上,改造了毕赤酵母的谷胱甘肽转运蛋白,以促使胞内积累GSH的外排,减小Gshlp受到的反馈抑制,最终达到提高GSH总产量的目的。本论文构建了一个多基因改造的工程菌株JC312(arg4, sGSHl, sGSH2, optl,sGEX1),即在毕赤酵母JC308(adel, arg4, his4, ura3)中表达了GSH合成酶基因sGSH1和sGSH2,同时敲除吸收转运子OPT1,并过表达外排来源于酿酒酵母的转运子sGEX1。通过此一系列的改造,GSH的摇瓶产量相对于初始菌株提高了90%,8L发酵罐发酵后产量在摇瓶发酵基础上又提高了一倍,达到173mg/L。