【摘 要】
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褐飞虱Nilaparvata lugens是水稻上的一种刺吸式口器害虫,对大多数常用的化学农药产生了较强的抗药性。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea可有效地防治褐飞虱等刺吸式口器害虫。为弄清玫烟色棒束孢表皮降解蛋白Ifcdp1在参与真菌侵染、杀死褐飞虱过程中与相关蛋白的识别与互作关系,本论文构建了经玫烟色棒束孢诱导的褐飞虱酵母双杂交c DNA文库,并从褐飞虱c DNA文库中筛选与If
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褐飞虱Nilaparvata lugens是水稻上的一种刺吸式口器害虫,对大多数常用的化学农药产生了较强的抗药性。玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea可有效地防治褐飞虱等刺吸式口器害虫。为弄清玫烟色棒束孢表皮降解蛋白Ifcdp1在参与真菌侵染、杀死褐飞虱过程中与相关蛋白的识别与互作关系,本论文构建了经玫烟色棒束孢诱导的褐飞虱酵母双杂交c DNA文库,并从褐飞虱c DNA文库中筛选与Ifcdp1蛋白互作的目标蛋白,从玫烟色棒束孢酵母双杂交c DNA文库中筛选与Ifcdp1蛋白互作的目标蛋白,为研究真菌侵染致病昆虫的分子机制提供参考。研究结果如下:(1)褐飞虱酵母双杂交c DNA文库的构建提取经玫烟色棒束孢诱导的褐飞虱若虫的总RNA,反转录为c DNA后经LD-PCR扩增获得双链c DNA,将双链c DNA和p GADT7-Rec载体通过同源重组方式共转化到Y187酵母感受态中,获得褐飞虱的酵母双杂交c DNA文库,经检测文库的转化效率为2.9×106cfu/3μg p GADT7-Rec、滴度为3.42×107cfu/m L、重组率为100%、库容为2.9×106cfu、插入的片段大小为500-2000bp。表明玫烟色棒束孢酵母双杂交c DNA文库的质量较好,可用于后续互作蛋白的筛选。(2)p GBKT7-cdp1诱饵载体的构建将玫烟色棒束孢表皮降解酶基因cdp1导入p GBKT7酵母载体中,构建了酵母诱饵载体p GBKT7-cdp1,经检测在Y2HGold酵母菌株中cdp1基因表达的诱饵蛋白无细胞毒性、无自激活性,可用于c DNA文库的目标蛋白筛选。(3)与玫烟色棒束孢Ifcdp1蛋白互作的褐飞虱目标蛋白筛选为了弄清玫烟色棒束孢表皮降解蛋白Ifcdp1参与降解褐飞虱体壁的分子机制,将含p GBKT7-cdp1诱饵载体的菌株与褐飞虱c DNA文库进行杂交,从c DNA文库中筛选出可能与Ifcdp1蛋白互作的候选目标蛋白。结果表明:从c DNA文库中筛选出89个蓝色的候选阳性菌落,对89个菌落进行PCR检测并送样测序鉴定,最终获得4个可能的目标样品,其中的第34号样品经ORF序列扩增与BLAST比对、确定其为褐飞虱的Ras蛋白,回复杂交证明Ras蛋白可与Ifcdp1蛋白发生互作。(4)与Ifcdp1蛋白互作的玫烟色棒束孢互作蛋白筛选为了弄清玫烟色棒束孢表皮降解蛋白Ifcdp1分泌的分子机制,以表皮降解蛋白Ifcdp1为诱饵从玫烟色棒束孢c DNA文库中筛选出参与互作的候选目标蛋白35个,对35个菌落进行PCR检测并送样测序鉴定,最终获得2个可能的目标样品,其中的第6号样品经ORF序列扩增与BLAST比对、确定其为玫烟色棒束孢的dynamin GTPase蛋白,回复杂交证明dynamin GTPase蛋白可与Ifcdp1蛋白发生互作。
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