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目的:甲硫氨酸作为人体必需氨基酸,具有促进神经系统生长发育、抗氧化等保护作用。其作为甲基供体可以调节DNA、蛋白质的甲基化修饰。有文献支持染锰能够引起神经细胞内tau蛋白过磷酸化和促进细胞凋亡。而tau蛋白磷酸化平衡是由蛋白激酶及蛋白磷酸酶调控。蛋白磷酸酶家族中的PP2A及其甲基化修饰在信号转导、磷酸化修饰中有重要意义,能够影响细胞增殖、分化及凋亡,且与神经退行性疾病密切相关。然而PP2A及其甲基化调控是否参与锰诱导的神经细胞毒性及潜在调控机理尚不明确。本研究主要从分子水平对甲硫氨酸调控PP2Ac甲基化在Mn诱导神经母细胞瘤细胞N2a损伤的保护作用及调控机制进行研究。方法:神经母细胞瘤细胞N2a被分成三组,并进行如下处理:(1)在无甲硫氨酸培养基中,锰处理24h,建立tau蛋白过磷酸化和凋亡的细胞模型;(2)重金属锰、甲硫氨酸共同处理N2a细胞24h;(3)锰和PPME1特异性抑制剂ABL-127共同孵育N2a细胞24h。经上述处理后,采用倒置显微镜观察细胞形态变化;刃天青法检测细胞的活性;采用细胞凋亡试剂盒检测细胞的凋亡变化;采用Western Blot分析细胞模型中tau蛋白不同位点的磷酸化蛋白表达,及对PP2Ac甲基化、去甲基化、PP2Ac磷酸化、LCMT1和PPME1等蛋白表达进行检测;采用活性氧检测试剂盒、GSH和GSSG检测试剂盒检测细胞内ROS、GSSG情况;采用高效液相色谱检测细胞内SAM、SAH的含量及SAM/SAH 比值的变化量。结果:1、在甲硫氨酸缺乏下,单独的锰暴露可诱导神经母细胞瘤细胞N2a的损伤:①表现为剂量依赖性地降低细胞活性,同时诱导细胞凋亡;②随着锰浓度的增加,N2a细胞内tau蛋白Thr199、Ser396、Thr202、Ser404位点的tau蛋白磷酸化表达增加,呈剂量-效应关系;且与无锰组相比较,差异具有统计学意义(p<0.05);同时锰的暴露也可诱导细胞内PP2Ac的去甲基化、PPME1及PP2Ac磷酸化蛋白的表达增加,然而PP2Ac甲基化、LCMT1蛋白表达降低。③Mn诱导N2a细胞损伤与氧化应激有关:随着锰浓度的增加,镜下细胞荧光亮度及细胞内ROS含量升高,然而还原型谷胱甘肽GSSG含量为下降趋势,呈剂量-效应关系,与无锰组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。④随着锰浓度的增加,细胞内SAM含量和SAM/SAH比值下降,而SAH含量增加。2、甲硫氨酸补充对锰诱导N2a细胞损伤中的作用及机制:①测试浓度范围内(0～20mg/L),甲硫氨酸对细胞无毒性作用,且随着浓度的增加,细胞活性增加,以10mg/L促进细胞活性为最明显;与甲硫氨酸缺乏组相比,甲硫氨酸补充可保护锰诱导的N2a细胞凋亡;②在相同浓度的锰暴露下,甲硫氨酸补充可降低Thr199、Ser396、Thr202、Ser404位点的tau蛋白磷酸化表达;同时逆转锰诱导升高的PP2Ac去甲基化、PPME1及PP2Ac磷酸化蛋白表达的增加,而显著增加PP2Ac甲基化、LCMT1蛋白的表达,差异具有统计学意义(p<0.05)。③补充甲硫氨酸可降低镜下细胞荧光亮度及细胞内的ROS含量,而增加细胞内抗氧化物质GSSG的含量,与甲硫氨酸缺乏组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。④甲硫氨酸对蛋氨酸代谢循环影响结果显示:无锰暴露下,甲硫氨酸补充可以增加细胞内甲基供体SAM含量及SAM/SAH比值,并降低SAH含量;而在1000μmol/L的锰暴露下,甲硫氨酸可逆转锰诱导的SAM含量和SAM/SAH值的降低。与甲硫氨酸缺乏组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。3、ABL-127在锰诱导N2a神经母细胞瘤细胞tau蛋白过磷酸化和凋亡中的作用及机制:①在测试浓度范围内单独ABL-127干预对N2a细胞无毒性作用,且随着浓度的增加,细胞活性增加(0～10nmol/L),以0.5nmol/L细胞活性最高,差异具有统计学意义(p<0.05);②该浓度用于干预细胞染锰实验,结果显示ABL-127干预可以增加染锰诱导的细胞活性及降低细胞凋亡。③在相同浓度的锰处理下,Thr199、Ser396、Thr202、Ser404位点的tau蛋白磷酸化表达降低;PP2Ac的去甲基化、PPME1及PP2Ac的磷酸化蛋白表达均降低,然而PP2Ac的甲基化、LCMT1蛋白表达增加,与无ABL-127组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。④ABL-127干预可以降低相同浓度锰处理后N2a细胞镜下荧光亮度及ROS含量,呈剂量-效应关系;同时可增加细胞内GSSG的含量。与无ABL-127组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:1、本研究证实甲硫氨酸可以降低锰诱导的N2a神经母细胞瘤细胞活性降低、tau蛋白过磷酸化和细胞凋亡。2、甲硫氨酸可能通过参与甲硫氨酸代谢循环和抗氧化途径调控其下游的PP2Ac甲基化修饰减少或抑制Mn引起的tau蛋白异常磷酸化、氧化应激及细胞凋亡。3、PPME1抑制剂ABL-127可直接抑制PP2Ac去甲基化,增加PP2A的活性,进而减少Mn诱导的tau蛋白异常磷酸化、氧化应激及细胞凋亡。