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背景:血管内皮细胞(Vascular endothelial cell,VEC)是血管系统与血液之间的屏障,在维持血管完整性、调节血管平衡稳态过程中起关键作用。在衰老状态的VEC中,调控内皮依赖的血管收缩和舒张功能的炎性因子、凝血因子、抗氧化因子等表达水平发生变化,影响血管功能,促进血栓形成。 急性脑梗死(acutecerebral infarction,ACI)是由血液栓子引起的神经系统疾病,在老年人群中具有较高的发病率,严重影响了老年人的健康水平,而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块破裂是其主要病理基础。 血管内皮细胞衰老是血管功能紊乱及相关疾病如AS、ACI发生重要的初始事件。衰老的血管内皮细胞具有和其他机体衰老细胞相同的特征,也有其自身的特点,如血管黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、内皮素-1(endothelin-1,ET-1)表达增加、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)表达减少等。 大量临床和基础研究表明,AS进程中存在多种免疫细胞介导的慢性炎症反应,其中CD4+的淋巴细胞亚群,如Th1细胞、Th2细胞等以及众多细胞因子都参与其中。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)是一类新近发现的CD4+细胞亚型,因其高特异性地分泌促炎细胞因子白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)被命名为Th17细胞。Th17细胞可发挥很强的促炎效应,与炎症和自身免疫病的发生发展密切相关。T细胞根据CD45亚型表达与否,也分为初始T细胞和记忆T细胞,初始T细胞表达CD45RA,为未致敏T细胞,而记忆T细胞表达CD45RO,其高表达黏附分子,当抗原再次刺激时,即发生强免疫反应。 血管内皮细胞是血管内壁的重要组成部分,其衰老是AS发生发展的重要因素。Th17细胞在AS及ACI发生中发挥重要作用,然而,其在血管内皮细胞衰老中的作用尚未见报道。因此,本研究首先通过临床实验检测Th17/IL-17在不同年龄段健康人、老年ACI患者体内的表达变化,并通过细胞实验分析Th17/IL-17对血管内皮细胞衰老的影响,探讨其在ACI发生的新机制,并为防治ACI提供新靶点。 目的:探讨Th17细胞在不同年龄段健康人及老年ACI患者表达及变化,并分析其对血管内皮细胞衰老的影响,明确Th17/IL-17在血管内皮细胞衰老及ACI发生中的作用及意义,并初步探讨其机制。 方法:(1)本研究首先以健康青年人(30例)、健康中年人(33例)、健康老年人(34例)及老年ACI患者(36例)为研究对象,通过多色免疫荧光素法标记细胞抗原,采用多参数流式细胞术检测不同人群外周Th17细胞表达率;并分析不同人群Th17细胞中CD45RO和CD45RA的表达情况;逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测不同人群外周血单个核细胞中Th17细胞转录因子RORγt表达水平;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune-sorbent assay,ELISA)检测不同人群血清中Th17相关细胞因子(IL-17、IL-6)、血管内皮细胞衰老指标(ET-1、VCAM-1)、炎症标志物(ox-LDL、HCY)表达情况,并分析Th17/IL-17与血管内皮细胞衰老指标及炎症标志物表达水平的相关性。(2)通过人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)体外诱导实验,分析重组白细胞介素17(Recombinant Interleukin17,rIL-17)对血管内皮细胞衰老进程的影响。首先将HUVEC分为对照组和rIL-17干预组。将HUVEC贴壁培养在细胞爬片上12h后,rIL-17诱导组中加入rIL-17,对照组加等量PBS,继续培养72h。然后,通过?-半乳糖苷酶染色检测HUVEC衰老情况,并收集对照组和干预组细胞并提取RNA,用RT-PCR法检测内皮细胞衰老指标VCAM-1、eNOS和VCAM-1表达水平。 结果:(1)健康老年组外周Th17细胞表达率、相关细胞因子(IL-17)浓度和Th17细胞转录因子RORγt表达显著高于健康青年组和健康中年组(均P<0.05),而老年ACI组外周血以上指标又明显高于健康老年组(均P<0.01)(2)各组人群Th17细胞CD45RO表达率(健康青年人81.94±6.21%;健康中年人78.42±5.18%;健康老年人83.21±4.72%;老年ACI患者85.42±7.56%)和CD45RA表达率(健康青年人5.94±1.21%;健康中年人7.42±2.38%;健康老年人6.71±2.03%;老年ACI患者5.12±1.65%)均未见明显差异(均P>0.05),表明各组Th17细胞均高表达记忆性标志CD45RO。(3)健康老年组血管内皮细胞衰老指标(ET-1和VCAM-1)、炎症标志物(ox-LDL、HCY)血清浓度均明显高于健康青年和健康中年组(均P<0.05),而老年ACI组各项指标又明显高于健康老年组(均P<0.05)。(4)Th17细胞表达率与内皮细胞衰老指标(ET-1、VCAM-1)及炎症标志物(ox-LDL、HCY)血清浓度均呈显著正相关,IL-17血清浓度与上述指标浓度亦呈显著正相关(均P<0.01)。(5)细胞实验发现,HUVEC rIL-17诱导组?-半乳糖苷酶染色阳性率显著高于对照组(P<0.01)。(6)rIL-17诱导组HUVEC ET-1及VCAM-1表达水平明显高于对照组(均P<0.01),而eNOS水平则明显减低(P<0.05)。 结论:(1)随着年龄增长,健康人外周Th17/IL-17表达水平、内皮细胞衰老指标(ET-1和VCAM-1)血清浓度均明显升高;老年ACI患者上述指标升高更为显著。Th17/IL-17的表达水平与ET-1、VCAM-1水平呈显著正相关。(2)IL-17可诱导血管内皮细胞衰老。(3)随着年龄增长,健康人炎性标志物(ox-LDL、HCY)血清浓度均明显升高;老年ACI患者上述指标升高更为显著。Th17/IL-17的表达水平与ox-LDL、HCY水平呈显著正相关。由此可见,Th17/IL-17与VEC衰老密切相关,IL-17还可诱导VEC衰老,在ACI发生中发挥重要作用。