研究背景和目的:缺氧是临床上非常常见的病理表现，可以造成多系统、多器官的损伤，而神经系统对于缺氧最为敏感。缺氧可造神经细胞不可逆损害，引起一系列的临床症候群，严重时脑功能活动停止，出现脑死亡。当神经细胞坏死后，由于神经细胞的不可再生性，即使缺氧等因素去除后，仍可留有神经系统后遗症。国内外主要采用改善脑循环、促进脑代谢、抗凝及脱水等药物治疗，并从降低神经细胞坏死和凋亡等方面加强和改进了治疗措施，对缺血半暗带的损伤显示了一定的治疗效果，但不能使己坏死的神经细胞再生，对于已发生坏死的脑组织，临床疗效不满意。因此，有必要寻找一种切实有效的修复受损脑组织的治疗方法。 干细胞是具有自我复制，高度增殖及多向分化潜能的细胞群体，一方面可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成各种不同的组织细胞，从而构成机体复杂的组织器官。目前，国内外一些研究表明，骨髓间充质干细胞(MSCs)具有自我更新、高度增殖以及在特定条件下进行多向分化的特性，包括向神经元样细胞分化的潜能。动物体内实验表明，外源性MSCs不仅可在正常小鼠的脑内转变为神经元，表达神经特异核蛋白(NeuN)；还可以在脑组织缺血缺氧性损伤的情况下，在体内诱导分化为有一定功能的神经元细胞。在脑细胞坏死急性期存在氧自由基、溶解酶、吞噬细胞等，不利于MSCs存活。脑缺氧时，防御和应激反应可触发和启动一系列内源性神经保护，此时移植可能更有利于MSCs存活增殖及向神经细胞分化。但后期胶质瘢痕形成会阻碍神经突起发育，影响神经再生与重建。缺氧后不同时间脑组织提取液对MSCs有何影响，在脑缺氧性损伤后何时进行移植为最佳时间，目前国内外鲜有报道。 本课题拟研究对于缺氧造成神经损伤的小鼠，在缺氧后不同时段提取其脑组织匀浆提取液对MSCs进行诱导，能否将MSCs诱导成为神经元样细胞；及比较不同时段的诱导液诱导MSCs成神经元样细胞的阳性率，寻找移植最佳时间。为体内实验以及今后临床移植的开展提供实验依据。 实验方法一、骨髓间充质干细胞(MSCs)纯化体外和培养1、MSCs的分离培养及形态学观察无菌条件下取正常儿童骨髓(自愿供者)2ml，加入含有1.5ml的10％肝素液的离心管中，充分混匀.加入适量PBS液混匀，以1000r/min离心10min，吸净上液；再用PBS液洗一遍(方法同前)，用含10％FBS的完全培养液悬浮细胞，将其接种在25CM2培养瓶中，37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中原代培养。倒置相差显微镜下每日观察1次。72小时半量换液，去除杂质细胞及未贴壁的细胞。约90％贴壁细胞接近融合时，用PBS冲洗2次以除去培养瓶中的含血清培养基，以适量0.25％胰蛋白酶-EDTA室温消化，将细胞悬液按1∶2或1∶3比例传代接种。待传代细胞生长接近完全融合时，可继续传代。 2、MSCs的鉴定MSCs培养至第5代时，以适量0.25％胰蛋白酶-EDTA室温消化，PBS洗2次后吹打成单细胞悬液送流式细胞仪室检测CD34、CD44、CD29。 二、脑缺氧小鼠动物模型的建立及脑匀浆诱导液的制备1、脑缺氧小鼠动物模型的建立将6～8周正常成年昆明小鼠(雌性)放入密闭的透明塑料箱中，通含8％O2及92％N2的混合气体，气体流量为2L/min，箱体的另一端与外界相通，以保持箱内的压力与大气一致。箱内置钠石灰以吸收小鼠呼出的CO2，水硅胶以吸收水蒸气。通气2.5小时后，将小鼠放出，恢复正常通气于自然空气中。 2、脑匀浆诱导液的置备将缺氧小鼠随机分为5组，每组8只(n=8).分别在缺氧后1天(A1)，4天(A4)，7天(A7)，10天(A10)，13天(A13)引颈处死.在无菌条件下取出脑组织.一侧脑组织以10％福尔马林固定，以备制作病理切片用；一侧脑组织称重，按每150ml湿重加1ml的L-DMEM培养基的比例研磨，将研磨好的脑匀浆以2000r/min，离心10min，吸取上清夜，以0.22um微孔滤膜过滤除菌后制备成诱导液，-20℃冰箱保存备用。使用时37℃水浴解冻，按20％比例以L-DMEM培养基稀释使用。 三、MSCs诱导成为神经元样细胞及细胞免疫化学鉴定1、MSCs诱导成为神经元样细胞将P5代MSCs细胞按104～105/ml浓度接种到12孔板中。接种48小时后细胞贴壁生长良好，将12孔板中的含血清的完全培养基吸净，用PBS洗2次，分为三组(A、B、C)，分别加入已配制好的诱导液。置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中继续培养，每1小时倒置相差显微镜下观察一次，记录细胞形态变化。 A组：加入缺氧小鼠脑匀浆诱导液B组：加入正常小鼠脑匀浆诱导液C组：加入L-DMEM培养基对照2、MSCs诱导为神经元样细胞的免疫化学鉴定及阳性率表达诱导液作用8小时之后，用荧光免疫组化的方法检测神经元样细胞所特有的兔抗人神经元烯醇化酶(NSE)、及神经胶质细胞所特有的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，加入荧光二抗CY3(羊抗兔免疫球蛋白)，阳性细胞在荧光显微镜下呈红色荧光。神经元样细胞免疫组染色后显微镜下随机数取8个非重叠视野(×100)计算阳性细胞占总细胞数的比例，结果用均数±标准差表示。 结果一、MSCs的纯化和体外培养1、MSCs原代培养及传代正常儿童骨髓接种于培养瓶3天后，可见少量细胞贴壁，7天可见较多贴壁细胞出现，12～14天细胞接近90％融合。传代后细胞生长较原代培养增快，3～4天可再次传代，可见细胞呈漩涡状排列。 2、MSCs的鉴定经流式细胞仪检测，第5代细胞CD34阴性，CD44、CD29阳性。表明纯化的细胞为骨髓间充质干细胞。 二、脑缺氧动物模型的制作将6～8周正常成年昆明小鼠(雌性)放入密闭的透明塑料箱中，通含8％O2及92％N2的混合气体。在通气的2.5h过程中，小鼠相继出现烦躁、活动减少、平衡失调、抑制嗜睡及全身抖动的现象。 制作的病理切片表明：显微镜下见正常对照组大脑组织结构层次清晰细胞轮廓正常，核居中，核仁清楚。缺氧模型组出现大脑皮质、纹状体、海马和丘脑见坏死细胞溶解，神经元核固缩，以海马区的锥状细胞层最为明显；病灶中心见固缩核和核碎片，病灶周围有少量胶质细胞增生。随时间推移神经元坏死、变性趋于稳定，病灶周围增生星形胶质细胞增多，皮层、纹状体、海马和丘脑形成少量胶质瘢痕。 三、MSCs诱导成为神经元样细胞及其免疫化学鉴定1、MSCs诱导成为神经元样细胞MSCs诱导3小时后，就可见少量细胞出现形态改变，MSCs细胞向核收缩，胞体变圆，折光性变强；6小时后，可见一部分细胞转变成类似神经元样细胞的形态，突起伸出。8小时后，突起数目由开始的两极发展到3～5个多极，并在轴突末端出现一级和二级类似树突的分支，有些细胞突起相互连接形成网状结构。对照组细胞仍保持原有形态不变。 2、MSCs诱导成神经元样细胞的免疫化学鉴定及阳性率表达脑组织提取液诱导8小时后，那些折光性强有突起的细胞表现为NSE染色强阳性，荧光显微镜下呈红色。各组NSE的强阳性表达率为与A1(11.69±2.10％)、A4(13.66±2.31％)、A7(15.09±2.28％)、A10(21.02±3.38％)及A13(14.68±4.44％)，其中A10组的阳性率最高，与其他各组有统计学差异。B组(20.48±3.16％)，除A10组外，其他各组均低于B组，有显著性差异。GFAP染色无明显阳性细胞。对照C组无明显NSE和GFAP阳性细胞出现。 结论1.缺氧小鼠脑匀浆提取液均可在体外诱导MSCs成为神经元样细胞。 2.缺氧后10天，小鼠脑匀浆提取液诱导MSCs为神经元样细胞的阳性率最高，与其他各时段有显著统计学差异。 3.随时间增加，诱导阳性率也逐渐递增，到10天达高峰，之后下降。除A10组外，其他各组均低与正常组B。