目的树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞,它是免疫反应的枢纽。动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是一种脂质相关的慢性免疫炎症性疾病。近年来研究显示,DCs可能影响As的起始和进展。已证明多种与As相关的抗原物质可诱导DCs的成熟,而DCs的成熟是其作用完全发挥的必要条件。本实验从C57BL/6J小鼠骨髓中分离培养DCs,研究LDL和HDL发生氧化后,对DCs趋化作用和成熟活化的影响;确定oxLDL和oxHDL作为自身抗原,引起DCs的迁移和成熟活化,导致局部的免疫反应和As的起始。方法颈椎脱位法处死C57BL/6J小鼠,取股骨和胫骨,剔除周围肌肉,离断干骺端后,用注射器吸取RPMI-1640培养液冲洗骨髓腔,获得单细胞悬液。利用动物树突状细胞专用分离液和细胞黏附性差异去除大部分巨噬细胞和淋巴细胞,用rmGM-CSF和rmIL-4诱导单个核细胞向DCs分化,并抑制淋巴细胞生长。隔天半量换液,补足所需细胞因子和培养液,培养至第7天,轻轻吹打收获,即为未成熟的骨髓源性树突状细胞(bonemarrow derived dendritic cell, BMDCs)。从形态学、分子标志表达和抗原提呈功能三方面联合鉴定:(1)光镜观察BMDCs生长过程中形态变化;扫描电镜拍摄成熟和未成熟BMDCs的形态;并粗略计数具有突起样细胞的百分比;(2)免疫荧光和流式细胞术联合检测3种以上的BMDCs表面标志物的表达;(3)混合淋巴细胞反应(MLR)反映BMDCs提呈抗原的能力。用浓度分别为50μg/ml的oxLDL和oxHDL处理BMDCs,同时设立同源蛋白的对照(分别为50μg/ml LDL和50μg/ml HDL)和阴性(PBS)、阳性对照(1μg/ml LPS)。采用Transwell迁移系统,观察各实验组处理因素对BMDCs趋化作用的影响;流式细胞术检测各实验组BMDCs CD86和MHCⅡ的表达率;液体闪烁计数检测各实验组BMDCs刺激同源的性T细胞增殖的能力;将获得的各组BMDCs注射到C57BL/6J小鼠腹腔,流式细胞术检测迁移到脾脏的BMDCs数目,体内间接证明各处理因素对BMDCs成熟的影响。结果C57BL/6J小鼠骨髓单个核细胞在rmIL-4和rmGM-CSF刺激下,符合DCs生长的一般规律,即从第3天开始,细胞形态变为圆形或者类圆形,半贴壁,呈“葡萄串”或者呈簇生长;其中还可见到少量长突起的杂细胞。培养至第7天,大量细胞出现类圆形或者不规则形态。以LPS刺激成熟后,扫描电镜发现细胞突起更加明显,免疫荧光发现表达33D1和CD11c的细胞数均达到80%以上;流式细胞术检测CD86和MHCⅡ的细胞表达率分别为99.0%和32.5%;混合淋巴细胞反应提示成熟的BMDCs能明显刺激同源T细胞的增殖。因此,我们获得的细胞基本符合实验所需。实验分为PBS阴性对照组、LDL组、oxLDL组、HDL组、oxHDL组和LPS阳性对照组,采用Transwell迁移系统模拟细胞跨血管壁过程,结果发现,与PBS对照组相比,除LDL组外,发生迁移的细胞明显增加,氧化修饰性脂蛋白比相应的脂蛋白更能趋化BMDCs发生移动。流式细胞术检测CD86和MHCⅡ的表达率,结果发现,分别与LDL、HDL相比,oxLDL、oxHDL能明显促进CD86(84.7%vs68.7%和90.8%vs73.8%)和MHCⅡ(26.0%vs15.2%和25.9%vs11.4%)表达,但仍低于LPS刺激组(99.0%和32.5%)。同样,氧化脂蛋白刺激的BMDCs组能更好地促进同源T细胞的增殖(cpm值:992±150.00vs 645±21.17;996.3±212.81vs652±50.59)和细胞因子(IL-12和IL-10)的分泌。而且oxLDL和oxHDL诱导的BMDCs更接近LPS刺激的成熟状态,LDL和HDL诱导的BMDCs成熟分子标志和混合淋巴细胞反应都明显低于LPS组,其成熟只能达到一种“半成熟”状态。体内迁移实验证实了同样的结果,以氧化修饰性脂蛋白处理的BMDCs在24小时内迁移到脾脏的细胞数目更多(细胞百分数:5%vs2%;8%vs2%)。结论(1)分别与LDL和HDL相比,oxLDL、oxHDL更能趋化C57B/6J小鼠BMDCs向Transwell下室移动,提示氧化性脂蛋白可能直接趋化DCs进入血管内膜。(2)oxLDL、oxHDL处理的C57B/6J小鼠BMDCs ,其CD86和MHCⅡ的表达、混合淋巴细胞反应和细胞因子(IL-12和IL-10)分泌都明显升高;提示氧化性脂蛋白更能促进BMDCs的成熟活化。(3)将oxLDL、oxHDL处理的BMDCs回输到C57B/6J小鼠体内后,迁移到脾脏的细胞数目明显增加;证明oxLDL和oxHDL可促进C57B/6J小鼠BMDCs的成熟。