研究背景:　　线粒体呼吸链的多个复合体可以进一步组装成更大的超级复合体，但是只有超级复合体Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn可以直接从NADH传递电子到氧。由于线粒体是为机体产生能量供应极为重要的细胞器，因此线粒体呼吸链超级复合体在人类疾病中发挥了重要的作用，比如癌症与衰老等。近年来，有报道称在小鼠中超级复合体Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn的组成形式是否存在主要与小鼠核基因背景相关。然而，我们的研究发现超级复合体Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn的组成形式在不同人与小鼠的细胞系中都存在。我们将靠近CⅤ二聚体最近的超级复合体定义为LSC，以往的文献报道认为LSC仅由Ⅰn+Ⅲn组成，我们通过非变性胶分析，发现在部分人与小鼠的细胞系中LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn组成。并且我们通过确认LSC中cytc的存在辅助验证了LSC具有完整的传递电子的功能，进而说明LSC可能是一个可以行使呼吸功能的实体。此外，我们发现一个由于LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)缺陷而引起功能缺陷的线粒体复合体Ⅰ编码基因ND1上m.3697G＞A突变导致的Leigh综合征的病人的呼吸功能下降以及ATP生成减少。通过本课题的研究，我们验证了LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)可能是有功能的实体，并且是因其缺陷会导致疾病发生的一个重要因素。　　目的:　　1、通过研究发现，不同细胞系的超级复合体组成是有差异的，由于以往的报道中多数细胞系的LSC仅由Ⅰn+Ⅲn组成，我们选定多种小鼠以及人的细胞系进行验证LSC的组成。　　2、筛选线粒体复合体Ⅰ相关的核基因(NDUFS3)以及线粒体基因(ND1、ND6)突变的线粒体代谢疾病的患者，分别构建永生化细胞系和融合细胞系。研究不同核基因背景以及线粒体背景的细胞模型LSC的组成差异。　　3、通过2D BN/SDS-PAGE验证LSC中cyt c的存在以及用氯霉素(CAP)处理监测其动态变化过程（组装与去组装），验证LSC在线粒体呼吸链超级复合体中的重要功能。　　4、通过对构建的高低异质率细胞模型(ND1: m.3697G＞A)检测其线粒体功能差异性，揭示线粒体遗传学背景在Leigh氏综合征中的发生发展机制及其临床诊断应用价值。　　方法:　　1、通过BN-PAGE技术检测小鼠的3A19（C57BL/6J鼠源）细胞系的超级复合体的组成形式，并从C57BL/6J小鼠肝脏组织提取线粒体蛋白，进行CⅠ和CⅣ的IGA验证了超级复合体的活性。　　2、通过BN-PAGE技术检测了小鼠的HIB1B、A9、3T3-L1和C2C12细胞系，人的Hela、MDA-MB-231以及143B细胞系的超级复合体的组成形式。　　3、查阅文献，确定本课题所用细胞系的来源。　　4、通过BN/SDS-PAGE技术在143B及HIB1B细胞系中验证LSC的组成差异。　　5、构建三个正常人以及核基因(NDUFS3)突变家系的永生化细胞系;收集并抽取患者外周血，提取其淋巴细胞构建永生化细胞系。通过BN-PAGE技术检测构建的永生化细胞系的超级复合体的组成形式。　　6、通过BN/SDS-PAGE验证LSC中cyt c的存在，进一步确认LSC是否存在完整的传递电子的功能。　　7、通过BN-PAGE技术，研究加入CAP培养HIB1B与C2C12细胞系后，LSC的组装与去组装动力学。其中HIB1B细胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn组成，C2C12细胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn组成。　　8、构建线粒体基因(ND1) m.3697G＞A突变的线粒体代谢疾病（Leigh Syndrome）的家系的融合细胞模型，收集并抽取患者外周血，提取血小板，用来构建融合细胞模型。通过酶切鉴定细胞克隆异质率，挑选高低异质率克隆各一个，分别为L、H细胞系，并用线粒体通用24对引物PCR扩增mtDNA全序，通过全序分析验证两个细胞克隆。　　9、对3697位点进行保守性分析;对m.3697G＞A家系抽血提取DNA，PCR后进行测序分析。　　10、通过BN-PAGE技术检测L、H细胞系的复合体Ⅰ的胶内酶活性，五个单一复合体总量的变化，以及CⅠ、CⅢ、CⅣ相关的超级复合体的组装形式。以及SDS-PAGE检测五个复合体亚基的变化。并通过BN/SDS-PAGE技术再次确认LSC在两个细胞克隆中的组成差异。　　11、通过BN-PAGE技术，研究加入CAP培养L、H细胞系后LSC的组装与去组装动力学。　　12、构建线粒体基因(ND6)m.14487T＞C突变的线粒体代谢疾病（Leigh Syndrome）的家系的融合细胞模型，收集并抽取患者外周血，提取血小板，用来构建融合细胞模型;挑选高低异质率克隆各一个。通过BN-PAGE技术检测高低异质率克隆的超级复合体的组成形式。与m.3697G＞A的超级复合体形式进行比较。　　13、将L、H细胞系培养至最佳状态后，检测两者的线粒体功能，分析两者的线粒体功能差异性。　　1)应用Clark氧电极检测L、H细胞系氧耗量。　　2)应用TMRM荧光染料检测L、H细胞系膜电位水平。　　3)应用ATP检测试剂盒检测L、H细胞系产生ATP的水平。　　4)应用乳酸检测试剂盒检测L、H细胞系的乳酸产生量。　　5)应用ROS检测试剂盒检测L、H细胞系ROS的产生水平。　　14、统计学分析:应用SPSS16.0软件分析L、H细胞系之间复合体表达量和线粒体功能的差异。　　结果:　　1、通过BN-PAGE技术检测了小鼠及人的多个细胞系的超级复合体的组成形式。LSC有两种形式，3A19、HIB1B、A9以及Hela细胞系中LSC仅由Ⅰn+Ⅲn组成;3T3-L1、C2C12、MDA-MB-231以及143B细胞系中LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn组成。　　2、查阅文献，确定本课题所用细胞系的来源。3A19细胞系源自C3H非整倍体小鼠;HIB1B细胞系源自C57BL小鼠;A9细胞系源自Swiss Webster小鼠;3T3-L1细胞系源自Swiss albino小鼠;C2C12细胞系源自C3H整倍体小鼠;Hela细胞系源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯（Henrietta Lacks）的子宫颈癌细胞;MDA-MB-231细胞系源自高加索人乳腺癌细胞;143细胞系源自高加索入骨肉瘤细胞。　　3、通过BN/SDS-PAGE技术在143B及HIB1B细胞系中验证确认了LSC的组成差异与BN-PAGE一致，即143B细胞系LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn组成;HIB1B细胞系LSC由Ⅰn+Ⅲn组成。　　4、通过BN-PAGE技术检测三个正常人构建的永生细胞系的LSC由Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn组成;在NDUFS3突变家系的永生化细胞系中可以发现与正常对照比较，LSC的含量下降了。　　5、通过BN/SDS-PAGE技术检测LSC（Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn）中是否存在cyt c，发现Hela细胞系中仅可以检测到CⅠ和CⅢ，然而143B细胞系中不但可以检测到CⅠ和CⅢ，还可以检测到CⅣ和cyt c。证明了LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)的确是有完整的呼吸功能的实体。　　6、通过使用不影响mtDNA拷贝数，但是可逆抑制线粒体蛋白翻译的药物CAP处理细胞。首先研究组装动力学，通过结果可得，移除CAP4h开始LSC就开始进行组装，通过灰度分析计算可得，在4-48h时间段里，检测CⅠ相关的超级复合体，HIB1B细胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn)增加了32倍;C2C12细胞系的LSC（Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn）增加了25倍。CⅢ相关的超级复合体得到一致的趋势，可得C2C12细胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)组装相对较慢。　　7、通过研究去组装动力学，分析结果可得，在0-24h的时间段里，检测CⅠ相关的超级复合体，HIB1B细胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn)下降了71.18％; C2C12细胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)下降了36.07％。CⅢ相关的超级复合体得到一致的趋势，可得C2C12细胞系的LSC(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)去组装相对较慢。　　8、通过在多个物种中对3697位点进行保守性分析，发现该位点十分保守，一旦该位点发生突变，可能会对人体产生极大危害。　　9、通过对m.3697G＞A家系，对照（母亲）及患者（儿子）进行测序分析，一代测序结果显示对照无突变或突变极低，二代测序显示该患者为100％突变。　　10、通过PCR-RFLP对m.3697G＞A家系挑出的细胞克隆进行鉴定，最后筛选到异质率为0％的细胞克隆L以及100％的细胞克隆H来进行后面的研究。　　11、通过对L、H细胞系的mtDNA测全序，发现除3697位点G＞A突变外，无其他突变。　　12、通过胶内酶活性结果可得H细胞系的活性相对于L细胞系下降了约30％; CⅠ的含量下降了约35％，CⅡ、CⅢ、CⅣ、CⅤ的含量没有差异。所以m.3697G＞A突变仅仅导致了CⅠ的缺陷。　　13、通过SDS-PAGE分析可得L、H两个细胞系的五个复合体亚基水平没有差异。所以，并不是由于复合体亚基水平下降而导致CⅠ的表达下降。　　14、通过BN-PAGE分析可得两个细胞克隆超级复合体亚基除了LSC有差异，P＜0.05，其他超级复合体没有差异。所以，m.3697G＞A的致病可能是由于LSC的组成差异引起的。　　15、通过BN/SDS-PAGE研究进一步确认了L、H两个细胞系LSC的差异，L细胞系的LSC中的CⅣ含量明显高于H。　　16、通过对L、H细胞系加药CAP研究其组装动力学，可得L细胞系LSC的组装明显快于H细胞系。进一步说明LSC的差异极有可能是引起疾病发生的原因。　　17、通过研究发现m.14487T＞C家系挑选的高低异质率细胞克隆中并没有发现与m.3697G＞A突变类似的LSC变化。说明LSC的差异在m.3697G＞A中是特异存在的。　　18、通过检测L、H细胞系的线粒体相关的功能，L细胞系相比于H细胞系来说，其线粒体的氧耗量较高，膜电位水平较高，线粒体CⅠ产生的相关的ATP水平较高，乳酸及ROS的产生量较低。说明L细胞系的线粒体OXPHOS功能更强。　　结论:　　1、源于不同人与小鼠的多种细胞系的超级复合体的组成形式不同，由上述的1-5实验结果得出，核基因背景不同影响了超级复合体的组成形式;并且我们发现 LSC的组成形式分为Ⅰn+Ⅲn与Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn。通过LSC中cyt c的检测确认其有完整的呼吸功能。　　2、选用HIB1B细胞系(Ⅰn+Ⅲn)与C2C12细胞系(Ⅰn+Ⅲn+Ⅳn)进行LSC的组装与去组装动力学研究。由上述的6-7实验结果得出，C2C12细胞系的组装与去组装较HIB1B细胞系慢。得出结论，包含CⅣ的超级复合体比没有CⅣ的超级复合体更加稳定。　　3、通过非变性胶技术对L、H高低异质率细胞系的OXPHOS完整性进行研究，由上述的8-17实验结果得出，可得MT-ND1 m.3697G＞A突变损坏了LSC的组成，进而引起疾病的发生。　　4、通过线粒体功能方面的检测，确认m.3697G＞A突变在生物学功能方面影响了OXPHOS功能。由上述的18-22实验结果得出，H细胞系相较于L细胞系来说，复合体Ⅰ相关的氧耗降低了，MMP降低了，ATP生成减少，乳酸产生量增加，ROS产生量也增加。更进一步确认了该突变损伤了CⅠ进而导致线粒体功能缺陷。