宫颈癌是妇科恶性肿瘤死亡的主要病因。分子生物学研究发现,高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与90%以上的宫颈癌有着密切的联系,进而发现尤其是HPV16型在各地区HPV亚型分布中居于主导地位。高危型人乳头瘤病毒以两种方式途径感染宫颈上皮细胞。在HPV急性感染中,完整病毒DNA游离地存在于宿主细胞,并自主完成生活周期,产生新的感染病毒颗粒。而在少数HPV感染病人身上,病毒环状基因组整合进宿主细胞染色体,导致高级宫颈内皮瘤病变,甚至可能发展为浸润性宫颈癌。感染病毒的早期基因E2丧失功能,E6持续表达在诱发宫颈癌的过程中发挥着重要作用。目前,高危型HPVE2与宫颈癌细胞E6表达和细胞增殖的关系,以及其表达抑制宫颈癌发生发展的机制仍是尚待解决的问题。为了探讨HPV16型E2基因对宫颈癌发展过程的影响,本研究在原核表达系统中诱导表达并纯化E2蛋白,制备抗HPV16E2抗血清。同时,在SiHa细胞中表达外源基因HPV16E2,以鉴定E2蛋白表达对HPV16E6基因表达和SiHa细胞生长状态的影响。研究结果初步表明,E2蛋白能够在大肠杆菌BL21中表达,纯化蛋白在SDS-PAGE电泳上显示单一条带。ELISA和Western blotting检测表明获得的E2抗体具免疫特异性。半定量PCR和细胞计数结果可分别说明,HPV16E2在SiHa细胞中的表达能够抑制内源基因HPV16E6 mRNA表达,并显著降低SiHa细胞的增殖数。由上述实验结果推测,HPV16E2可以结合早期基因启动子,控制人乳头瘤病毒致癌基因的表达,抑制细胞无限增殖,从而对癌症治疗起到一定作用,这为进一步探索宫颈癌的基因治疗方案提供了线索。研究主要包括以下几部分内容:1. HPV16E2基因原核、真核表达载体的构建根据人乳头瘤病毒16E2基因cDNA序列设计一对引物,采用PCR的方法从新疆维吾尔族妇女宫颈癌样本中扩增HPV16E2基因的目的片段并将其插入到原核表达载体pMAL-p2X中。再由构建好的pMAL/HPV16E2重组质粒亚克隆目的基因片段,纯化回收后插入真核表达载体pCDNA3中,构建HPV16 E2基因的真核表达载体pCDNA3/HPV16E2。2. HPV16E2基因原核表达及抗血清的制备为进一步研究HPV16E2基因的功能,将构建好的重组质粒pCDNA3/HPV16E2,免疫小鼠。原核表达重组质粒转化大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导表达MBP/E2融合蛋白,表达产物用麦芽糖亲和层析柱纯化。将纯化后的重组蛋白作为检测抗原,ELISA和Western blotting结果表明pCDNA3/HPV16E2免疫小鼠产生了特异性强的抗体。本研究所构建的真核表达载体pCDNA3/HPV16E2及所获得的抗HPV16E2抗体,为在细胞水平上研究HPV16E2基因表达及基因功能提供了有力的工具。3. HPV16E2表达对SiHa细胞生长的影响利用脂质体转染法将真核表达质粒pCDNA3/HPV16E2导入SiHa细胞,表达E2蛋白,观察转染SiHa细胞中HPV16E6 mRNA表达及细胞增殖的情况。RT-PCR和Western blotting结果分别显示E2在SiHa细胞中产生mRNA和蛋白质水平的表达。与转染pCDNA3空载体的对照组比较,转染pCDNA3/HPV16E2组的HPV16E6 mRNA表达明显受到抑制,且SiHa细胞增殖数显著低于对照组(P<0.05)。