多种牙源性炎性病损,如智齿冠周慢性炎症、慢性牙周炎、慢性根尖周炎以及种植体周围炎等,均会导致牙槽骨吸收破坏、牙或种植体丧失支持结构,是造成牙列缺损、缺失并且修复困难的最主要原因,严重危害人类口腔功能及健康。这些病变的共同特点是局部骨组织被炎性肉芽组织（inflammatory granulation tissue,IGT）侵蚀替代,故而IGT一般被认为属于病理性组织。临床治疗策略上,在清理治疗牙髓或牙周等致病因素的同时,还要求手术清除局部IGT,即便是患牙无法保留需要拔除,也要求刮除牙槽窝内的IGT,以免影响骨再生愈合。但牙槽骨炎性病损所致的IGT与牙槽骨愈合过程中形成的修复性肉芽组织（restorative granulation tissue,RGT）均是组织尝试修复的产物,且二者在组织学组成方面存在一定的相似之处,即二者均含有大量毛细血管及纤维;两者最大的区别在于细胞组成及纤维形态的不同,即IGT中纤维组织排列稀疏,结构不成熟,内含较多炎细胞;而RGT是以成熟的成纤维细胞及其分泌的胶原纤维为主。此外,目前已有研究证实牙槽骨IGT中存在具有成骨向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）。因此,理论上,只要处理得当,IGT能够向RGT转化,进而修复骨缺损。组织蛋白酶K（cathepsin K,CTSK）作为骨代谢的关键调控因子,已有研究证实抑制CTSK可通过影响破骨细胞及免疫系统有效阻止骨质丧失,进而预防牙周炎及根尖周炎的发生与发展,但能否治疗已发生的牙槽骨炎性病损尚未见相关报道。近年来还有研究表明MSC亦表达CTSK,且其内源性CTSK可能与细胞的成骨活动相关,这使得CTSK有望成为治疗多种炎性骨病的潜在靶点。于是,本课题首次提出抑制CTSK促进IGT向RGT转变可能是治疗牙槽骨炎性病损、促进牙槽骨再生的一个新策略。为了证实这一假设,本课题主要从以下5个方面展开研究。第一部分:CTSK在人牙槽骨炎性肉芽组织中的表达及分布目的:明确CTSK在人牙槽骨IGT中的表达及分布,为进一步研究CTSK在牙槽骨IGT转归中的作用奠定基础。方法:收集人慢性牙周炎、根尖周炎及智齿冠周炎等不同病因导致的IGT,通过苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,H＆E）染色明确不同类型IGT的组织学特征;利用实时定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）及蛋白质印迹法（western blot,WB）检测上述组织中CTSK的表达;通过免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色揭示CTSK在人IGT中的分布;通过免疫荧光（immunofluorescence,IF）染色检测人IGT中是否存在MSC及其中CTSK的表达。结果:四种不同类型的人牙槽骨IGT的组织学特征基本一致,均由大量炎性细胞、毛细血管和排列稀疏的纤维组织组成。IGT中均未检测到破骨细胞的存在,但却可以检测到CTSK的表达,CTSK广泛分布于淋巴细胞、浆细胞、血管内皮细胞及细胞外纤维组织中。RT-q PCR及WB结果表明四种IGT中CTSK的表达均显著高于健康牙槽骨或牙周膜（P＜0.001）。结论:人牙槽骨IGT中CTSK的表达显著增高,但CTSK在牙槽骨IGT转归中的作用还有待于进一步研究。第二部分:炎性肉芽与修复性肉芽的组织学差异目的:揭示IGT与RGT之间的组织形态学差异以及CTSK、Osterix等的表达差异。方法:征集需要延期自体牙移植的患者3例,拔除患牙时收集IGT,2周后牙移植时收集因治疗需要去除的RGT。通过H＆E染色明确IGT与RGT之间的组织形态学差异;通过Masson染色及IHC染色揭示IGT与RGT之间细胞外基质的差异;利用IHC染色揭示两者间血管亚型、CTSK表达及Osterix阳性细胞等方面是否存在差异。结果:IGT与RGT均含有炎细胞、纤维组织及毛细血管。但不同的是IGT中绝大多数细胞为嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎细胞,而RGT中则主要是成纤维细胞伴散在炎细胞浸润,且组织边缘部位可见大量Osterix阳性细胞;IGT中仅有少量排列稀疏且不成熟的纤维组织,而RGT中含有大量有序排列且成熟的纤维组织;IGT与RGT中均可见CD31强阳性表达的血管,EMCN阳性血管仅见于RGT;IGT与RGT中均可以检测到CTSK的表达,与IGT相比,RGT中CTSK水平下调至76.97%（P＜0.01）。结论:IGT与RGT在组织学层面既有相似之点又有不同之处,能否寻得特异性靶点,调控IGT向RGT转化亟需进一步研究。第三部分:炎性肉芽与修复性肉芽的生物信息学差异目的:揭示IGT及RGT之间的生物信息学差异,以期寻得促进IGT向RGT转化的特异性调控靶点。方法:征集需要延期自体牙移植的患者7例,拔除患牙时收集IGT,2周后牙移植时收集因治疗需要去除的RGT。从两种肉芽组织中提取总蛋白,委托上海吉凯基因化学技术有限公司进行串联质谱标签（tandem mass tag,TMT）标记定量蛋白质组学分析;利用京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）对差异表达蛋白（differentially expressed protein,DEP）进行通路富集分析,采用双尾Fisher精确检验来检验差异丰富蛋白相对于所有鉴定的蛋白的富集程度,并在北京基因组学研究院提供的Dr.Tom平台上进行蛋白-蛋白相互作用和共表达分析。结果:与IGT相比,RGT中存在555个DEP,这些DEP可富集到4927个基因本体论（gene ontology,GO）词条中,P＜0.001的59个词条中17个与细胞外基质（extracellular matrix,ECM）有关,4个与炎症有关,只有1个与血管生成有关。共有49个DEP参与了5条与细胞外基质、炎症、血管生成相关的KEGG通路。COL1A1是其中表达上调最为显著,且是蛋白-蛋白相互作用调节网络中一个重要的枢纽,且CTSK表达量下调69.10%-76.97%（P＜0.05）。但黏着斑（focal adhesion）、PI3K-Akt信号通路及血管生成相关蛋白COL1A1、COL1A2、FN1和TGF-β1均有显著上调。结论:CTSK有望成为调控IGT向RGT转化的重要靶点,其调控作用可能依赖于细胞外基质途径,但仍需进一步研究证实。第四部分:CTSK调控炎性肉芽组织来源细胞生物学特性的研究目的:揭示炎性肉芽组织来源细胞（inflammatory granulation tissue derived cell,IGTC）与修复性肉芽组织来源细胞（restorative granulation tissue derived cell,RGTC）在生物学特性方面的差异,进而探索CTSK抑制剂奥当卡替（odanacatib,ODN）对IGTC生物学特性的调控作用。方法:组织块法体外分离培养IGTC及RGTC,利用流式细胞仪检测CD29、CD90、CD105、CD146、CD31和CD45等细胞表面标志物。利用WB、IF明确IGTC与RGTC中CTSK的表达及定位;通过CCK-8及划痕实验揭示两种细胞增殖及迁移能力的差异;利用WB、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红染色明确两者成骨分化能力的差异。对IGTC施以ODN刺激后观察其相应生物学特性的改变。结果:IGTC与RGTC表面标志物符合MSC表面标志物特性。IGTC与RGTC均表达CTSK,且CTSK主要分布于溶酶体内,但IGTC中CTSK的表达量明显高于RGTC（P＜0.001）。IGTC增殖与迁移能力较RGTC均明显增强;ODN对IGTC增殖能力无明显影响,但可明显降低IGTC的迁移能力。与RGTC相比,IGTC中I型胶原蛋白（COL I）、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）、ALP表达水平均明显降低,其形成矿化结节能力也相对减弱;ODN刺激可显著提高IGTC中COL I、RUNX2及ALP的表达及体外形成矿化结节的能力。结论:IGT及RGT中均可以分离培养出符合MSC表面特性的细胞,但IGTC的成骨分化能力明显减弱。ODN可以部分恢复IGTC的成骨分化能力。第五部分:ODN治疗大鼠牙周炎的可行性研究目的:初步观察ODN对大鼠牙周炎的治疗效果,为探索微创、有效的牙槽骨炎性病损治疗新方法奠定基础。方法:利用双侧上颌第一磨牙腭侧注射LPS的方法建立SD大鼠牙周炎模型。通过Micro-CT和H＆E染色分析口服ODN 4周对大鼠牙周炎的治疗效果。通过Masson染色、TRAP染色,CTSK、COL I及Osterix的IHC染色揭示ODN治疗大鼠牙周炎的作用途径。结果:与正常对照相比,牙周炎组上颌第一、二磨牙间牙槽骨显著吸收（0.59±0.065 mm vs 1.00±0.022 mm,P＜0.001）;ODN治疗组局部牙槽骨高度有部分恢复（1.00±0.022 mm vs 0.84±0.052 mm,P＜0.01）。ODN治疗后局部炎症反应减弱、新生纤维趋向成熟,Osterix+细胞数及COL I表达明显升高。结论:ODN对大鼠牙周炎有一定的治疗作用,但是否是通过调控IGT向RGT转化仍需深入研究。