肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有782,000新发病例。作为病死率第二位的恶性肿瘤,肝癌每年致746,000人死亡,其中一半以上的死亡病例发生在中国。乙肝病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的感染是目前肝癌的主要的危险因素。由于缺乏用于肝癌早期诊断的灵敏特异的生物标志物,肝癌患者常常错过最佳治疗期,临床预后较差。目前最常见的用于肝癌诊断的生物标志物为甲胎蛋白(Alhpa Feto Protein,AFP),但其在肝癌早期诊断中的价值较为有限。因此,寻找出新型的、高效的生物标志物用于肝癌的早期诊断对于提高肝癌患者的治疗效果及预后状况具有重要意义。近年来的研究发现,微小RNAs(microRNAs,miRNAs)作为一类新型抑癌基因和癌基因在肿瘤的发生发展、侵袭及转移等方面扮演重要角色。成熟的miRNAs通过与其对应的目标mRNA序列结合,导致mRNA的翻译受到抑制或者降解,以此来达到调控目标基因的目的。单独的一个miRNA分子可参加调控成百上千的功能各异的目标基因。越来越多的研究结果表明,来源于靶组织的miRNAs如肿瘤组织的miRNAs,在肿瘤的临床诊断和预后预测中具有很好的指导作用,是一类重要的候选肿瘤生物标志物。但因靶组织取样困难以及创伤性等问题,其临床应用受到局限。2008年,国内外多个研究团队几乎同时发现血浆/血清中广泛存在miRNAs。血浆/血清中的miRNAs不但含量丰富、性质稳定,而且易于精确定量检测。其后,循环mi RNAs作为肿瘤生物标志物具有巨大应用前景这一不争的事实被多个研究团队证实。以肝癌为例,目前的循环minras与肝癌相关性的研究已经阐明了一些mirnas的重要意义,但是不同研究结果之间存在着异质性。这些结果不一致的原因主要与样本收集和处理过程,检测的平台以及数据标化的方法不一致有关,也与不同危险因素的暴露存在关联。如国外研究的肝癌患者主要是hcv阳性的肝癌患者,但是中国地区主要的研究对象则为hbv阳性的肝癌患者。此外,国内也有利用血浆筛选出在肝癌患者中表达异常的mirnas作为早期诊断标志物的研究,但是由于没有组织筛选,无法追溯mirnas的来源。为进一步阐明起源于肝脏组织并且能够区分hbv感染者与hbv阳性肝癌的,在中国人群中具有肝癌早期诊断价值的循环mirnas,我们设计了一个多中心的三阶段研究。第一阶段:利用taqman低密度表达芯片(taqmanlowdensityarray,tlda),1.组织样本:(1)分别检测hbv阳性的肝癌患者的肝癌组织、癌旁组织以及hbv阳性的肝炎肝硬化患者的肝炎组织(4例hbv阳性的肝癌病例和1例肝炎肝硬化病例)中mirnas的表达谱,通过两两比较差异表达的mirnas,即为组织中与肝癌相关的mirnas;2.血浆样本:(1)分别检测hbv阳性的肝癌患者术前的血浆与hbv阳性的肝炎肝硬化患者术前血浆中的mirnas的表达谱,筛选出与肝癌相关的mirnas(4例hbv阳性的肝癌患者术前血浆和1例肝炎肝硬化患者术前血浆);(2)分别检测hbv阳性的肝癌患者术前血浆与hbv阳性的肝癌患者术后血浆(4例hbv阳性的肝癌病例术前血浆与1例hbv阳性的肝癌病例切除术后血浆)中的mirnas表达谱,筛选出肝脏起源的mirnas;(3)分别检测hbv阳性的肝癌患者肝癌移植术前的血浆与移植术后血浆(3例hbv阳性的肝癌患者肝癌移植术前和移植术后的血浆)中的mirnas的表达谱,将在肝脏移植术后患者血浆中表达上调的mirnas剔除;通过上述策略,最终筛选出由肝脏起源的,与肝癌相关的10个循环mirnas(mir-19a-3p、mir-19b-3p、mir-20a-5p、mir-25-3p、mir-30a-5p、mir-92a-3p、mir-132-3p,mir-185-5p、mir-320a和mir-324-3p)(在肝癌或对照中表达ct值低于35,且表达差异4倍以上)。第二阶段:通过对单个血浆样本(患者/对照)进行实时定量pcr(rt-pcr)检测10个mirnas的表达情况,验证初筛的mirnas;分为两个部分(1)第一部分:在35例hbv阳性的肝癌患者及在年龄与性别匹配的50例hbv感染者的血浆中检测mirna表达水平,发现上述的10个mirnas在hbv阳性的肝癌患者血浆中表达水平均高于对照组(p<0.05),由于其中四个mirnas(mir-19a-3p、mir-19b-3p、mir-20a-5p和mir-92a-3p)均位于肿瘤mirna17-92簇中,且两个mirnas(mir-19a-3p和mir-19b-3p)与mir-20a-5p存在显著相关。因此,在第二部分仅检测了8个mirnas(mir-20a-5p、mir-25-3p、mir-30a-5p、mir-92a-3p、mir-132-3p、mir-185-5p、mir-320a和mir-324-3p)(2)第二部分:在32例hbv阳性的肝癌患者及32例hbv感染者的血浆中检测8个mirnas的表达水平,检测发现这8个mirnas在hbv阳性的肝癌患者血浆中的表达水平均显著高于对照组(所有p<0.05)。为了进一步评价上述8个mirnas在肝癌诊断中的应用价值,我们基于上述样本(即35例hbv阳性的肝癌患者和50例hbv感染者)进行参数估计,根据受试者工作特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve,roc)来确定各个mirna的最佳诊断界值,在确认最佳诊断临界值后,进行风险评分(s=0/1).根据logistic回归分析的回归方程中的回归系数来确定各个mirna在mirnas组合中的权重,以风险评分为基础以及各自对应的mirna权重来对每例样本的危险分值(rsf)进行估计。结果显示,上述的8个mirnas组合的auc为0.823(灵敏度82.9%,特异度74.0%)。然后,应用第二阶段第一部分确定的最佳诊断界值在第二阶段的第二部分样本中评价了8个mirnas的诊断价值,该阶段的结果显示8个mirnas组合的auc为0.780(灵敏度78.1%,特异度68.7%);两部分合并的auc为0.802(灵敏度86.6%,特异度74.0%)。第三阶段:为了探讨筛选出的mirna是否具有早期诊断的价值,我们进行了巢式病例对照研究。两个前瞻性队列分别位于江苏常州以及江苏启东。其中江苏常州队列,截止2013年11月,有20例hbv阳性的肝癌患者,我们在队列中选取了基线资料匹配的40例hbv感染者为对照;江苏启东队列截止2003年12月,有667例HBV阳性的肝癌患者,随机选取其中50例作为病例组,在未发病HBV感染者中随机选取37人作为对照。在上述总计147例样本中检测了11个miRNAs的表达情况(8个miRNAs以及文献报道且与我们TLDA芯片筛选结果方向一致的3个miRNAs分别为miR-192-5p、miR-21-5p和miR-375)。采用meta分析合并两个队列的数据,发现其中4个miRNAs(mi R-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌患者中的表达水平显著高于对照(Pmeta<0.05)。为了进一步评价筛选出的这4个miRNAs(mi R-20a-5p、mi R-320a、miR-324-3p和miR-375)在肝癌早期诊断中的价值。我们联合AFP结果,在常州队列和启东队列中分别利用ROC曲线确定每一个miRNAs及AFP的最佳临界值,然后对每一个个体的表达值进行风险评分,同样利用ROC曲线确定最佳临界值,以最佳临界值为依据将个体评为危险1或者不危险0。使用Logistic回归分析对每个miRNA与肝癌发病的关联进行评估。我们发现,4个mi RNAs在常州队列中的AUC为0.768(灵敏度65.0%,特异度77.5%,阳性预测值59.1%,阴性预测值81.6%),AFP的AUC为0.575(灵敏度15.0%,特异度100.0%,阳性预测值100.0%,阴性预测值70.2%);miRNAs与AFP合并的AUC为0.789(灵敏度70.0%,特异度77.5%,阳性预测值60.9%,阴性预测值83.3%);在启东队列中,4个miRNAs的AUC为0.706(灵敏度56.0%,特异度83.3%,阳性预测值82.4%,阴性预测值58.5%),AFP的AUC为0.579(灵敏度16.0%,特异度100.0%,阳性预测值100.0%,阴性预测值46.8%);miRNAs与AFP合并的AUC为0.767(灵敏度64.0%,特异度83.8%,阳性预测值84.2%,阴性预测值63.3%)。本次研究利用肝脏组织与血浆样本共同筛选,得到来源于肝脏且与肝癌相关的10个血浆miRNAs。在肝癌的诊断方面,我们发现其中8个miRNAs在HBV阳性的肝癌患者中显著高表达,通过评估诊断价值后,发现这8个血浆miRNAs具有较好的诊断价值。在早期诊断方面的,通过巢式病例-研究对照研究,在两个独立的队列中验证得到4个具有早期肝癌诊断价值的血浆miRNAs。