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研究目的:胰腺癌仍然是目前医学界最具有挑战性的疾病,特别是那些失去外科手术机会或者术后复发的晚期胰腺癌患者,长期生存率依然很低。胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是最为普遍的胰腺癌类型,跟KRAS基因突变密切相关。近期大量研究表明,在基因工程小鼠模型中,胰腺上皮内瘤变（Pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN）主要是起源于胰腺腺泡上皮细胞并由其分化而来,最终进展为PDAC。由于Kras上下游的多条信号通路可能在胰腺腺泡上皮-导管上皮的分化过程中起到重要作用,我们推断,选择性地阻断这些通路有可能使小鼠PanIN和PDAC的导管上皮表型逆分化为正常腺泡上皮细胞表型,起到治疗作用。同时我们也研究了表观遗传相关药物是否能够诱导这一逆分化事件。研究方法:首先我们使用Mist1CreERT2/+;LSL-KrasG12D;R26mTmG（“KCiMist1G”）小鼠的 PanIN组织以及 Kras+/G12D;Trp53+/LSL-R172H;Pdx1-Cre（“KPC”）小鼠的PDAC 组织分别建立体外“KCiMist1G”PanIN organoids及“KPC”PDAC organoids培养体系。我们首先对PanIN organoids进行体外选择性药物处理,包括MAPK抑制剂、MMP抑制剂、MEK抑制剂、GSK31抑制剂、PI3K抑制剂、PKCiota抑制剂、HDAC抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂及Sirt1抑制剂等。我们通过使用免疫印迹、免疫荧光及定量PCR等方法检测所处理organoids腺泡及导管上皮细胞标记物的表达水平变化,从而分析它们的分化状态。随后我们再筛选出效果较好的药物处理PDAC organoids,进一步观察PDAC恶性导管表型是否能出现逆分化。最后我们建立了小鼠PDAC organoids在裸鼠体内的原位移植瘤模型,并初步观察了GSK3β抑制剂在体内对胰腺癌细胞分化状态的影响。结果:在小鼠“KCiMist1G”PanIN organoids体外模型中,GSK31抑制剂氯化锂（LiCl）、PKC iota抑制剂ATM、及MMP抑制剂GM6001处理后可以将腺泡上皮细胞标记物如Amylase、Elastase及CPA1的mRNA的表达水平提高2-4倍。与此同时,导管上皮细胞标记物如CK19、HNF1B及Muc5ac的mRNA表达水平被显著下调。随后我们用这三种药物对小鼠“KPC”PDAC organoids模型进行体外时间梯度处理（3天、6天及9天）,发现LiCl能显著提高部分腺泡上皮细胞标记物的mRNA表达水平（Mist1及CPA1）,并且显著降低导管上皮细胞标记物的mRNA表达水平（SOX9、CK19、HNF1B及Muc5ac）,提示“KPC”organoids的导管上皮细胞表型被部分逆转为腺泡上皮细胞表型。我们还用不同浓度的LiCl对“KPC”PDAC organoids处理了 6天,发现腺泡上皮细胞标记物Mist1及CPA1的蛋白水平表达呈现浓度依赖性地升高。而β-catenin信号靶基因Axin2及Lef1分子mRNA表达水平的下调,提示LiCl体外处理PDAC organoids可以导致β-catenin信号通路转录活性的降低。考虑到表观遗传相关调控,在PanIN organoids模型中,HDAC抑制剂SAHA、DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza联合处理后,腺泡上皮细胞标记物Elastase及CPA1表达水平显著上升1.5-3倍,而导管上皮细胞标记物表达水平均出现明显下降;HDAC抑制剂SAHA、Sirt1抑制剂EX527联合处理后,腺泡上皮细胞标记物Amylase、Elastase及CPA1表达水平升高2-4倍,而导管上皮标记物表达水平也均出现下调,其中Muc5ac的表达水平下降最为明显。随后我们仍然使用5-Aza及EX527分别联用SAHA处理PDAC organoids,发现SAHA/5-Aza联用使得Amylase表达提高50倍以上,CPA1表达提高20倍以上,而S AHA/EX527联用使得Amylase表达上调到10倍以上,提示S AH A/5-Aza及SAHA/EX527分别联用处理使得PDAC organoids出现了部分腺泡上皮细胞表型。随后我们建立了裸鼠PDAC organoids原位移植瘤模型,成功模拟了低级别PanIN-高级别PanIN-PDAC这一胰腺肿瘤发展的顺序进程,并初步观察到LiCl处理胰腺癌小鼠可以在体内诱导出部分腺泡上皮细胞表型,导致部分逆分化。结论:选择性阻断Kras相关信号通路及表观遗传学相关调控可以将小鼠PanIN及PDAC organoids的导管上皮细胞表型部分逆转为腺泡上皮细胞表型。而在我们选择的所有药物中,似乎GSK31抑制剂单独使用,及DNA甲基转移酶抑制剂和Sirt1抑制剂分别与HDAC抑制剂的联合应用能够达到最佳的逆分化效果,因此我们认为GSK31、DNA甲基转移酶、Sirt1及HDAC等有可能成为人PDAC及PanIN的有效治疗靶点。而这些抑制剂在已经患有PanIN及PDAC的小鼠体内诱导逆分化的潜在效应以及相应的分子生物学机制目前正在研究中。同时我们也证明,小鼠胰腺肿瘤organoids及裸鼠原位PDAC organoids移植瘤模型将成为我们今后研究胰腺癌发生发展机制与临床干预措施的绝佳体外和体内模型。