研究背景与目的心血管疾病是世界范围内第一致死、致残疾病。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的主要致病原因,占90%。早期诊断、干预AS,有望降低心脑并发症的风险,但目前AS极早期的诊断及治疗手段仍然有限,进一步探讨新的诊疗方法具有重要意义。外泌体是新近研究发现的细胞间信息交流的重要途径,可携带蛋白质、mRNA、miRNA等物质,直接参与了细胞间的信息交流,且具有稳定性、靶向性的特点。疾病状态下,细胞分泌的外泌体中的miRNA等组分会发生改变,能够较好地反映来源细胞的病理状态,由于外泌体具有囊泡结构,其内miRNA不易降解,稳定性高,因此内源性外泌体miRNA是理想的疾病诊断标志物。此外,外泌体因具有靶向性高、免疫原性低、细胞毒性低等优点被认为是良好的核酸药物运输载体。然而,在miRNAs特别是mRNA装载上,还缺乏高效的装载策略。本研究旨在:1)筛选动脉粥样硬化发生发展的血浆外泌体生物标志物,并与超声诊断结果比较,明确其是否能作为防治动脉粥样硬化的靶点;2)开发体内外泌体干预策略,提高外泌体装载核酸效率,为利用外泌体防治动脉粥样硬化提供依据。研究方法一、筛选动脉粥样硬化相关差异Exo-miRNA随机选取2018年4月至2018年10月就诊于我院超声科行颈部血管超声检测的受检者127例,作为研究对象。采集动脉粥样硬化相关临床资料。收集对照及AS患者血浆样品5ml,提取外泌体。随机抽取动脉粥样患者和正常对照各6例,送锐博生物公司行高通量测序,筛选两组受检者血浆外泌体中差异miRNAs。在此基础上,确定候选miRNAs,通过实时定量PCR定量分析候选miRNAs在对照及患者之间的变化,统计分析候选miRNAs表达与超声影像诊断之间的相关性。二、高效装载目的miRNAs的工程化外泌体构建及体内效果验证外泌体改造:利用分子克隆技术构建CD9-HuR融合表达载体,转染293T cell后,并收集外泌体,验证CD9-HuR融合蛋白在细胞和外泌体的表达;通过电镜、粒径分析方法对对照外泌体及改造后外泌体大小进行分析;利用Western Blot对两种外泌体表面marker进行验证;以HuR能够结合的miR-155及antimiR-155-ARE为例,探讨装载效率,通过实时定量PCR检测对照外泌体及改造后外泌体中Control RNA及目的RNA的含量,验证目的RNA在改造外泌体中的装载效率。细胞和动物实验:将DiO标记的对照及改构外泌体与巨噬细胞THP1共培养,通过荧光共聚焦显微镜观察改造的外泌体被巨噬细胞的内吞情况;将DiR/DiI标记的对照及改构外泌体经尾静脉注射进入小鼠体内,运用小动物活体成像系统观察外泌体在各脏器的分布情况,通过各脏器冰冻切片观察外泌体在组织内的分布;通过qPCR检测外泌体携带的目的miRNA在各脏器的表达变化,进一步明确不同外泌体递送目的miRNA的效率。研究结果一、筛选动脉粥样硬化相关差异Exo-miRNAs本课题收集动脉粥样硬化患者82例,正常对照45例。对6例对照及6例患者血浆外泌体miRNAs表达进行二代测序结果显示,与正常对照相比,AS患者中173个miRNAs上调,195个miRNAs显著下调。扩大样本后,实时定量PCR结果进一步显示miRNA-155-5p和miRNA-139-5p在动脉粥样硬化血浆外泌体中升高。血浆外泌体中miRNA-155-5p和miRNA-139-5p与斑块严重程度呈显著正相关,有望成为动脉粥样硬化的诊断标志物和/或治疗靶点。二、高效装载目的miRNAs的工程化外泌体构建及体内效果验证构建了CD9-HuR融合表达载体,CD9-HuR融合蛋白在细胞内大量表达,并被分选到外泌体中。改构外泌体成功将RNA结合蛋白HuR连接到外泌体内,该外泌体在包装过程中能够高效富集目的RNA,并将目的RNA递送到受体细胞,发挥功能。体内实验证实,改构外泌体可以显著增加肝脏和脾脏中目的RNA的水平。结论1.血浆外泌体miRNA-155-5p和miRNA-139-5p表达与超声检测结果相关性好,是AS早期诊断的潜在生物学标志物。进一步探讨其在动脉粥样硬化发生中异常表达的原因及在疾病发生中的作用,有望发现AS治疗的新靶点。2.CD9-HuR融合蛋白改构的外泌体可以高效富集目的RNA,并成功将目的RNA递送至肝脏和脾脏等脏器,为外泌体靶向肝脏和脾脏调控机体代谢和炎症,防治AS提供新方法。