脓毒症是外来微生物(革兰阴性细菌)入侵机体后导致系统性免疫功能紊乱,最终导致脏器损伤的感染性疾病总称。随着医学发展,脓毒症的致死率已经降至15-25%,但其仍旧是威胁人类健康一个国际性难题,需要全球共同努力攻克。在研究药物治疗脓毒症方面,一些老药就成为研究的新宠,研究人员利用已知的药物库筛选出可能对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用明显的药物来治疗脓毒症。我们很荣幸地与约翰霍普金斯大学药学实验室合作,通过在已知药物库中筛选具有抑制脂多糖经典信号通路途径的药物,其中一个老药—甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)具有抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞中TLR-4、IRAK-4、IκB和NF-κB等蛋白的表达作用。在研究甲氨蝶呤抑制脂多糖导致的炎性反应时,甲氨蝶呤表现出明显的细胞毒性的药物特性。因此,如何能够避免或者减弱甲氨蝶呤治疗的毒副作用成为本课题研究焦点。甲氨蝶呤作为免疫抑制剂,能够抑制二氢叶酸还原酶活性影响细胞周期,常用于肿瘤和免疫性疾病治疗。甲氨蝶呤作为临床上最主要的自身免疫性疾病用药,存在着诸多的不良反应及副作用,如口腔炎、消化道反应、骨髓抑制等。临床治疗中,同时配合口服叶酸能够一定程度预防甲氨蝶呤诱导的细胞毒性等不良事件。在实验过程中,我们也发现低浓度剂量脂多糖可以保护甲氨蝶呤诱导的细胞毒性作用。所以紧接着,我们又发现低浓度剂量脂多糖保护甲氨蝶呤诱导的细胞毒性作用与细胞凋亡有关,并且深入探索研究发现这一作用是通过线粒体相关凋亡蛋白P53和Bcl-2家族调控的而与经典的NF-κB关系不紧密。因此,低浓度剂量脂多糖拮抗甲氨蝶呤诱导的细胞毒性作用机制研究,与叶酸解救疗法一样,可以为临床合理使用甲氨蝶呤减少毒副作用提供靶向干预依据,也为在甲氨蝶呤治疗脂多糖导致脓毒症的治疗中如何预防其副作用打开思路。不仅如此,深入研究低剂量脂多糖拮抗甲氨蝶呤诱导的细胞毒性作用,也能够从不同视角认识脂多糖的基本生理特性,为研究脂多糖相关性疾病提供一定的帮助。第一部分发现脂多糖对甲氨蝶呤诱导细胞毒性保护作用目的:探寻并证实脂多糖与甲氨蝶呤共刺激RAW264.7巨噬细胞后能够表现出脂多糖拮抗甲氨蝶呤诱导细胞毒性作用的两者最佳浓度。方法:(1)甲氨蝶呤对RAW264.7巨噬细胞毒性作用:设立0uM、0.001uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM甲氨蝶呤药物浓度刺激RAW264.7巨噬细胞,Alamar Blue法在酶标仪上检测光密度值后计算各组细胞活性。(2)根据甲氨蝶呤毒性实验结果,实验设计分为3大组:空白对照组、1um甲氨蝶呤组、10um甲氨蝶呤组,每组都以10倍稀释成0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml脂多糖分别干预,共刺激24小时,alamarblue法在酶标仪上检测光密度值后计算各组细胞活性。(3)同此部分(2)实验分组,共刺激24小时,显微镜下大体细胞计数,同时提取蛋白,通过bca法测定各组细胞总蛋白含量。(4)各组数据整理后进行相应统计学分析其中差异。结果:(1)甲氨蝶呤浓度达到0.1um时,细胞毒性开始显现(p<0.01)。(2)在甲氨蝶呤浓度为1um,10um时,10ng/ml和100ng/ml脂多糖能够一定程度拮抗甲氨蝶呤细胞毒性作用(p<0.01)。(3)在甲氨蝶呤浓度为1um,10um时,1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml脂多糖可以一定程度逆转甲氨蝶呤导致的细胞数量减少和总蛋白含量降低(p<0.01)。结论:10ng/ml和100ng/ml脂多糖能够一定程度拮抗甲氨蝶呤细胞毒性作用。第二部分脂多糖拮抗甲氨蝶呤细胞毒性与细胞凋亡密切相关目的:验证细胞凋亡参与调节脂多糖拮抗甲氨蝶呤细胞毒性作用。方法:(1)同第一部分(2)实验分组,各实验组加入设定浓度的脂多糖和甲氨蝶呤干预24小时,提取蛋白,通过westernblotting的方法检测各组细胞caspase-3和cleavagecaspase-3蛋白表达差异。(2)根据前期实验结果在6孔板种植巨噬细胞爬片,设立空白对照组、1um甲氨蝶呤组、10um甲氨蝶呤组,给予空白干预和脂多糖(10ng/ml)干预,行tunnel染色检测细胞凋亡情况,并统计tunnel-positive细胞数目和百分率。(3)各组数据整理后进行相应统计学分析。结果:(1)甲氨蝶呤可以上调cleavagecaspase-3蛋白表达,脂多糖可以一定程度逆转cleavagecaspase-3蛋白的上调(p<0.01)。(2)tunnel染色显示,10ng/ml脂多糖明显减少甲氨蝶呤诱导的tunnel-positive细胞数目和百分率(p<0.01)。结论:10ng/ml脂多糖能一定程度逆转甲氨蝶呤细胞毒性作用与细胞凋亡密切相关。第三部分脂多糖对甲氨蝶呤诱导细胞凋亡保护作用与nf-κb蛋白的相关性验证目的:验证脂多糖拮抗甲氨蝶呤诱导细胞凋亡作用与脂多糖经典通路蛋白nf-κb相关性。方法:同第一部分(2)实验分组。各实验组加入设定浓度的脂多糖和甲氨蝶呤干预24小时,提取蛋白,通过westernblotting的方法检测各组细胞中nf-κb和phosphate-nf-κb的蛋白表达差异;同时检测上清液中il-6和一氧化氮含量,提取蛋白,通过westernblotting的方法检测各组一氧化氮合成酶表达差异。结果:与空白对照组相比,甲氨蝶呤不能影响nf-κb蛋白及一氧化氮合成酶的表达水平,同时脂多糖导致的细胞炎性因子的表达也未被减弱(p>0.05)。结论:脂多糖一定程度逆转甲氨蝶呤细胞毒性作用与NF-κB信号通路无关。第四部分脂多糖通过线粒体相关蛋白P53及Bax/Bcl-2起到保护甲氨蝶呤诱导细胞凋亡作用目的:验证脂多糖通过线粒体相关凋亡蛋白P53及Bax/Bcl-2拮抗甲氨蝶呤诱导细胞凋亡作用。方法:(1)实验分为4组:空白对照组(C组)、10ng/ml脂多糖组(L组)、1uM甲氨蝶呤组(M组)、10ng/ml脂多糖和1uM甲氨蝶呤组(LM组)。各实验组加入不同浓度药物干预24小时,提取蛋白,采用Western blotting方法检测各组P53、phosphate-P53和Bax/Bcl-2蛋白表达差异。(2)实验继续分为4组:空白对照组(C组)、P53抑制剂Pifithrin-α组(PF组)、1uM甲氨蝶呤组(M组)、P53抑制剂Pifithrin-α和1uM甲氨蝶呤组(PFM组)。各实验组按设计给予药物干预24小时,提取总蛋白,采用Western blottin方法检测各组P53、caspase-3和cleavage caspase-3蛋白表达差异。(3)同第一部分(2)实验分组。按本部分实验设计给予药物干预24小时,行透射电镜检测各组细胞质中线粒体变化。结果:(1)脂多糖通过下调P53蛋白表达水平拮抗甲氨蝶呤诱导的细胞凋亡,而P53抑制剂Pifithrin-α可以逆转甲氨蝶呤诱导的cleavage caspase-3上调(p<0.01)。(2)脂多糖通过Bax/Bcl-2比率调节拮抗甲氨蝶呤诱导的细胞凋亡(p<0.01)。(3)透射电镜显示,脂多糖可以逆转甲氨蝶呤导致的线粒体损伤。结论:脂多糖通过线粒体相关蛋白P53及Bax/Bcl-2起到保护甲氨蝶呤诱导细胞凋亡作用。