黄鳝抗菌相关基因筛选及其组织表达分析

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随着养殖规模的逐渐扩大,黄鳝疾病的爆发越来越常见,特别是由嗜水气单胞菌引起的黄鳝出血病给黄鳝养殖业带来了巨大的打击。多年来,对该疾病的治疗主要以各种抗生素为主,然而施用抗生素带来的抗药性和安全问题成为关注的焦点,寻找新的安全有效的治疗方法成为科学研究的重点。病原体在侵入鱼类机体后,引发机体产生免疫反应,包括特异性免疫和非特异性免疫,抗菌肽是鱼体非特异性免疫过程的重要组成成分,是一种具有抗菌活性的多肽,有高效、广谱、安全等特点。对黄鳝抗菌肽的研究,有助于进一步认识该鱼类的免疫机理的细节,寻找针对黄鳝出血病新的、安全有效的治疗方法。
  本论文通过对健康黄鳝人工感染嗜水气单胞菌,检测并比较染病前后黄鳝血清中溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶四种免疫相关酶活性;通过转录组测序技术获得了健康黄鳝脾脏和感染嗜水气单胞菌24h后黄鳝脾脏转录组信息,并从信息中筛选出差异表达的抗菌肽等免疫相关基因;通过qRT-PCR技术检测Moronecidin抗菌肽基因在黄鳝肾脏、脾脏和肌肉中的表达量,进一步认识感染嗜水气单胞菌后黄鳝一些器官组织中该抗菌肽基因的表达变化规律。研究结果如下:
  1.嗜水气单胞菌对黄鳝血清中溶菌酶等四种免疫相关酶类活性的影响
  在感染初期,溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(T-SOD)等四种免疫相关酶活力都有不同程度的升高;LZM、T-SOD有先升高后降低的趋势;ACP和AKP活力在感染48h内总体上持续升高,但在后期ACP活力升幅不明显,在高浓度处理组AKP活力有下降的趋势。结果表明,感染嗜水气单胞菌初期,黄鳝非特异性免疫功能增强,免疫相关酶活力升高,且随菌液浓度升高而增强;而在感染后期,黄鳝免疫器官功能受损,免疫功能下降,导致酶活力下降。
  2.嗜水气单胞菌感染前后黄鳝脾脏转录组测序数据分析及免疫相关基因筛选
  测序共获得了22.04Gb数据,对照组124.36MbRowReads和处理组121.85MbRawReads,组装并去冗余后得到75,405个Unigene,总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为104,936,538bp、1,391bp、2,785bp和44.93%。然后将Unigene比对到七大功能数据库进行注释,最终分别有41,407(NR:54.91%)、45,446(NT:60.27%)、35,335(SwissProt:46.86%)、31,332(KOG:41.55%)、33,529(KEGG:44.47%)、3,656(GO:4.85%)以及32,861(InterPro:43.58%)个Unigene获得功能注释。使用Transdecoder检测出43,826个CDS。同时还检测出24,728个SSR分布于17,278个Unigene中,以及预测出7,102个编码转录因子的Unigene。对比分析发现有11350个差异表达基因,其中表达上调的基因有6060个,表达下调的基因有5290个。从免疫系统相关基因中挑选出3类共7个抗菌肽基因。
  3.嗜水气单胞菌感染对黄鳝Moronecidin基因表达的影响
  Moronecidin基因在健康黄鳝中就有表达,转录组测序获得的信息显示在感染嗜水气单胞菌后,黄鳝抗菌肽在脾脏中的表达量是健康黄鳝的4.01倍。qRT-PCR结果显示,感染嗜水气单胞菌后,Moronecidin在黄鳝脾脏、肾脏和肌肉中的表达量都明显上调,且在脾脏中的上调最为显著,在肌肉中的表达量最低。在感染48h后,各组织器官Moronecidin基因相对表达量有不同程度的降低,在肌肉中的降低趋势最为显著。
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