虎皮鹦鹉性腺microRNA组的高通量测序与分析

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动物、植物和病毒中发现多种micro RNA,每个micro RNA能够靶定成百上千种m RNA的不同位置,从而进行不同的上调下调功能。动物micro RNA功能如发育时间、神经元细胞命运、细胞增殖与分化、新陈代谢与衰老、细胞凋亡与器官形态发生都揭示micro RNA在调控动物个体出生与死亡有着尤其重要的作用。micro RNA在植物、哺乳动物、人中研究甚多,然而,在鸟类中的研究尚少,为了丰富鸟类中的micro RNA数据集,采用成体虎皮鹦鹉的卵巢(n=3)和精巢(n=3)提取总RNA,构建两个小RNA库,用高通量测序仪Hiseq 2500单道测序获取数据。基于以上实验数据拟解决如下科学问题:(1)虎皮鹦鹉micro RNA组的基本数据信息;(2)虎皮鹦鹉性腺micro RNA数据的比较分析;(3)筛选虎皮鹦鹉性腺micro RNA的差异表达信息;(4)micro RNA有无系统进化意义。主要的研究结果如下:1.小RNA序列文库的分析卵巢原始数据9,191,836和精巢原始数据6,383,927,经过接头去除、质量控制、片段长度筛选,保留有卵巢82.03%去除接头以及一些质量值较低的数据(clean reads)和精巢84.43%clean reads。最后,卵巢7,540,057序列中572,201 unique reads和精巢5,389,781序列中2,370,340 unique reads用来进行后续分析。2.新micro RNA的识别本研究中,我们预测了151个pre-mi RNAs,其中142个pre-mi RNAs编码了92个micro RNA家族,一共包括211个新的micro RNA(known)。211个新micro RNA(known)中有13个编码保守的micro RNA,仅仅在鸟类中出现,或首次在鸟类发现(现有数据中,其他鸟类没有,在其他物种中保守的已知micro RNA)。其他micro RNA不仅在鸟类,也在其他物种中发现。3.micro RNA家族在GGU基序和必需调控因子中的功能分析在本研究所有预测的micro RNA中,我们发现有77个micro RNA在GGU基序中的U位置发生变化,这很可能改变micro RNA的特异性靶标,从而对与之相关的细胞过程和基因表达产生更深层次的影响。GGU基序位于种子序列内部,本研究中77条micro RNA中有17条序列的种子序列不含GGU基序,GGU基序位于种子序列之外。发现mi R-9家族和mi R-140家族保守存在于虎皮鹦鹉micro RNA组中,大大丰富了鸟类发声学习领域的micro RNA数据支持。4.鸟类特有mi R-2954基因的q PCR验证及功能分析mi R-2954是鸟类中特有的micro RNA,且在雄性中的表达高于雌性,在鸡和珍珠鸟中都有发现且在雄性中高度表达。同时,我们通过随机取样进行q PCR验证生物信息学分析。mi R-2954的靶标基因会编码一个TLE4转录因子家族蛋白,包含了Ca MKIV、SCAMP1和SCAMP2可能与神经系统的某些特殊功能相关。在KEGG分析中,Mun-mi R-2954与发育、环境适应、神经系统、信号分子和互作都有关联。这些结果将提供很多有用信息用于今后的进一步研究。5.精巢、卵巢组织中显著差异表达的micro RNA筛选及进化分析本研究中,252个新的micro RNA共筛选得到17个显著差异表达micro RNA。其中Mun-novel6-3p、Mun-novel31-5p、Mun-mi R-1626-5p、Mun-mi R-215-5p和Mun-mi R-2954a-3p尤为显著表达。抽取Mun-mi R215-5p进行q PCR验证,基于前体结构对脊椎动物现有mi R-215的前体数据进行系统进化分析,发现pre-mi RNA在系统进化中的意义。本实验提供252个micro RNA前体数据,可用于后续进化分析研究。综上所述,本研究首次报道了虎皮鹦鹉micro RNA组原始数据,预测了211个新的micro RNA(known)和41个具有在生理和功能表达方面具有特异性调控功能的新micro RNA(novel)。此外,我们随机验证了一些在卵巢和睾丸中差异性表达的micro RNA(Mun-mi R-18b-5p,Mun-mi R-2954a-3p,Mun-mi R-215-5p,Mun-novel10-5p,Mun-novel24-3p)。mi RNA已成为强有力的调控分子,我们通过分析发现,某些mi RNA能够影响性别差异性表达。经过生物信息分析构建的两个小RNA文库自身的数据特征和q PCR随机验证,表明本研究构建的文库质量合格且数据真实可靠,这为进一步分析生物在性别特异性差异方面的生物机制和功能研究奠定了基础,也可用于进一步研究。
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