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目的近年来,肺癌的死亡率不断上升,其导致的死亡率位于各种肿瘤之首。NSCLC（Non-small cell lung cancer,非小细胞肺癌）占肺癌病例的85%。尽管治疗已取得了很大进展,但NSCLC患者的5年总生存率仍然很差。且耐药和复发的问题突出。已经设计了许多药物来靶向特定的信号分子,但是这些药物与严重的不良反应有关,限制了它们在临床中的效用,因此,考虑其他治疗肺癌的措施以及探索耐药后的治疗策略至关重要。在多个国家和地区进行的流行病学调查显示,绿茶的饮用可以降低肺癌的发生。其中EGCG（polyphenol（-）-epigallocatechin-3-gallat,多酚（-）-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯）是最主要的生物活性成分,且具有抗肿瘤的效果。此外,其靶点涉及多种信号途径,包括NF-κB（Nuclear factor kappa B,核因子-κB）。NF-κB在肺癌中高表达,通过调控细胞凋亡和修复相关靶基因的转录,可以诱导放疗或化疗耐药。尽管有令人鼓舞的临床前发现,但缺乏有效的全身及靶向递送,生物利用度低和稳定性差等问题,使得EGCG在人类癌症治疗中的应用受到限制。而对于纳米粒子而言其具有独特的物理特性,例如更高的组织渗透性,胶体稳定性和药物生物利用度以及相对较低的成本,因此可作为药物载体并且受到广泛的关注。因此本课题旨在探讨EGCG抑制肺癌细胞增殖的潜在分子机制,并研究低剂量的EGCG与NF-κB抑制剂（BAY11-7082）联用是否能在NSCLC体内外产生协同作用,并探讨其具体的分子机制。同时,建立一种纳米颗粒策略来克服EGCG在肺癌治疗中的缺点,并通过构建肺癌PDX（Patient-Derived tumor Xenograft,人源肿瘤异种移植模型）模型评估了优化的纳米制剂的功效,为EGCG治疗肺癌的临床应用,提高药物的稳定性奠定实验基础。并构建EGFR-TKIs（Epidermal growth factor receptor tyrosin kinase inhibitors,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂）获得性耐药的NSCLC细胞株,通过RNA-sequence技术挖掘和分析其耐药机制,研究低剂量的EGCG-NPs（EGCG nanoparticles,EGCG纳米粒）是否可以增敏EGFR-TKIs,减缓其耐药过程,从而为研究耐药后NSCLC选择合适的化疗药物提供依据。方法1 EGCG在肺癌细胞中通过抑制NF-κB信号途径发挥抗肿瘤作用采用MTT法和平板克隆法检测EGCG对肺癌细胞增殖的影响。Western blot和流式细胞术分析EGCG诱导的细胞凋亡。通过BLI（Bio-Layer Interferometry,生物层干涉法）检测蛋白NF-κB与EGCG之间的相互作用后,进一步检测EGCG联合BAY11-7082对肺癌细胞系A549和H1299增殖抑制的影响。通过CI（Combination Index,联合指数）评价EGCG和BAY11-7082体外联合用药对肺癌细胞毒性是否具有协同作用,并通过流式细胞术检测凋亡细胞。通过Western Blot和免疫荧光共定位检测两药联用对P-NF-κB的影响。采用双荧光素酶报告基因实验和RT-PCR验证了联合使用EGCG和BAY11-7082对NF-κB的活性以及下游相关基因的影响。利用划痕和Transwell迁移法检测EGCG联合BAY11-7082对细胞侵袭迁移的影响。进而,我们构建了A549细胞异种移植瘤裸鼠模型,在体内验证了两药联合的作用效果。2 EGCG-NPs增强EGCG对人肺癌组织的治疗效果通过复乳溶剂挥发法制备了EGCG-NPs。对纳米粒的表征、包封率和载药量、及体外释放行为进行系统性评估。比较了细胞对游离EGCG和纳米粒的摄取情况以及两者的抗肿瘤增效作用。通过流式细胞术评估EGCG-NPs对细胞凋亡的作用。通过Western Blot和RT-PCR评估EGCG-NPs对NF-κB信号传导的影响。PDX模型进而评估了优化的纳米制剂的抗肿瘤效应。3 EGCG-NPs降低NSCLC对EGFR-TKIs的耐药性采用浓度梯度递增的方法在体外对del 19突变的细胞系PC9进行诱导。分别建立第一代、第二代和第三代的EGFR-TKIs（厄洛替尼、阿法替尼和奥希替尼）耐药株:PC9/ER、PC9/AR和PC9/OR。通过细胞毒性实验检测耐药指数明确成功构建耐药株。利用Western Blot检测耐药细胞株与亲本PC9细胞中NF-κB和P-NF-κB的表达差异。对耐药细胞系和亲本细胞系进行二代测序,通过生信分析,以期能找到导致EGFR-TKIs耐药的原因。通过RT-PCR检测相关耐药分子的m RNA水平,并且采用MTT以及集落形成实验检测EGFR-TKIs联合EGCG-NPs对三株PC9耐药细胞株以及H1650和H1975细胞株增殖的影响。并进一步检测联合使用EGFR-TKIs和EGCG-NPs对NF-κB和P-NF-κB的蛋白水平以及NF-κB下游相关基因的影响。结果1 EGCG在肺癌细胞中通过抑制NF-κB信号途径发挥抗肿瘤作用EGCG在较高浓度下（A549细胞的IC50=86.4μM,H1299细胞的IC50=80.6μM）抑制A549和H1299细胞的增殖和迁移并诱导凋亡。分子相互作用实验表明,EGCG以高亲和力（KD=4.8×10-5 M）与NF-κB结合。因此这些抗肿瘤作用可能是通过抑制NF-κB信号通路实现的。在非小细胞肺癌中,相对低浓度的EGCG（20μM）协同有效的NF-κB抑制剂BAY11-7082（2.5、5μM）显著抑制肺癌细胞的增殖,迁移且诱导大量细胞凋亡。在异种移植瘤模型中也观察到了这种协同抗肿瘤作用,且未观察到明显的毒副作用。2 EGCG-NPs增强EGCG对人肺癌组织的治疗效果优化处方和工艺制备的EGCG-NPs粒径为175.8±3.8 nm,Zeta电位为-13.70±0.87 m V。纳米粒呈规则圆形,粒径分布均匀（PDI=0.096±0.015）。载药量与包封率分别为~14.2±0.3%和86.0±1.5%（n=9）。此外EGCG-NPs与游离EGCG相比,在发挥抗增殖作用和以较低剂量（12.5、25μM）诱导细胞凋亡方面呈现出约3-4倍的剂量优势。且EGCG-NPs比游离EGCG更有效地抑制NF-κB的活化以及下调NF-κB下游基因的表达。在人肺癌PDX模型中,EGCG-NPs组较游离EGCG组在增殖的抑制和NF-κB活性抑制以及促凋亡上显示出更强的效力。3 EGCG-NPs降低NSCLC对EGFR-TKIs的耐药性分别成功诱导建立厄洛替尼、阿法替尼和奥希替尼耐药细胞株PC9/ER、PC9/AR和PC9/OR。耐药指数分别为:180.051、128.15和269.38。且P-NF-κB在耐药细胞株中异常高表达。RNA-Sequence结果显示相较于亲本细胞三株耐药细胞株间共有的差异基因数是362个,通过KEGG通路富集分析,提示NF-κB可能在EGFR-TKIs耐药的调控中发挥作用。且RT-PCR表明NF-κB下游的BCL2、PARP1、BRCA1、AMF、IRF1、IGFBP2、HOXA9和SERPINE2在耐药细胞株中均显著提高,这一结果与测序结果相一致。且EGFR-TKIs联合使用EGCG-NPs可通过抑制NF-κB通路降低了NSCLC对EGFR-TKIs的耐药性。在H1650和H1975细胞中,EGFR-TKIs和EGCG-NPs亦具有协同抗增殖作用。结论EGCG在NSCLC治疗中具备良好的应用前景。本章研究结果表明低剂量的EGCG联合BAY11-7082通过抑制NF-κB信号通路增强EGCG在体内外的抗肿瘤效果;EGCG-NPs增强EGCG在体内外对人肺癌的治疗效果;EGCG-NPs通过下调NF-κB,降低NSCLC对EGFR-TKIs的耐药性,为EGCG肺癌的临床应用和提高药物稳定性提供实验依据,为减缓肺癌的耐药治疗提供了可能。