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研究目的： 通过运用基因重组技术构建hTERT启动子调控的canstatin基因分泌型真核表达载体phTERT-canstatin，并通过RT-PCR、Western blotting的方法检测其在MCF-7／ADR细胞中的肿瘤特异性表达；及通过MTT、形态学观察、FCM的PI染色法和AnnexinV-FITC／PI双标法检测其诱导人脐静脉内皮细胞ECV204的凋亡情况；继而研究canstatin基因联合hTERT启动子调控的TRAIL基因治疗人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的协同作用。 研究方法： 1．分泌型真核表达载体phtert-canstatin的构建及鉴定 设计包含NheⅠ和HindⅢ酶切位点的canstatin特异性引物，以质粒pETC为模板，PCR扩增带有人IgG γ链信号肽序列的canstatin基因，经NheⅠ和HindⅢ双酶切PCR产物，回收后连接入经相同酶切的phTERTluc1载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，LA平板筛选挑取阳性重组子，并经酶切、PCR、DNA测序分析鉴定。 2．hTERT启动子调控的canstatin基因靶向MCF-7／ADR细胞表达的检测 设立未转染组、phTERTluc1转染组和phtert-canstatin转染组，分别检测各组细胞canstatin的表达情况。 2．1 半定量RT-PCR检测各组细胞canstatin mRNA水平的表达转染后48h，收集各组2×10~6个细胞，提取细胞总RNA。利用反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增canstatin基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并拍照，光密度分析软件半定量测定各组细胞canstatin基因的表达情况。 2．2 Western blotting检测各组细胞canstatin蛋白水平的表达 转染后48h，收集各组5×10~6个细胞，以含1 mmoL／L PMSF的细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白质，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜，经canstatin特异性一抗、相应二抗孵育后，DAB显色分析各组细胞中