第一部分，TES高甲基化与病人预后相关性的研究　　背景和目的:胶质母细胞瘤(GBM)是进展最快、恶性度最高、致死率最高的脑肿瘤。GBM病人的预后很差，即使采用手术以及放化疗，病人的中位生存期只有12～15个月。不同的GBM病人采取相同的治疗方案，病人的预后不尽相同，有的生存期不到一年，而有的生存期可达三年。在过去十年里，胶质瘤分子水平的研究取得了重大进展。然而，研究出的与临床治疗及预后相关的分子生物标记很有限。MGMT甲基化、1p/19q缺失、IDH1突变被认为是预后好的分子标记。MGMT启动子高甲基化是目前唯一一个可以预测对烷化剂及替莫唑胺敏感性的靶分子。　　基因表达以及表观遗传修饰的高通量分析为GBM以及低级别胶质瘤提供了新的亚型分类，这些靶分子具有诊断和预后预测价值。为了发现与GBM预后相关的受甲基化调控的基因，我们对北京天坛医院的33例原发性胶质母细胞瘤(pGBM)和9例继发性胶质母细胞瘤(sGBM)进行DNA甲基化芯片分析。我们发现在这些病人中TES的甲基化状态是不同的，并且把TES做为进一步研究的对象。　　TES基因最初是被Tatarelli等人发现的。位于染色体7q31.2脆性部位FRA7G。该基因编码421个氨基酸，C端含有3个串联的富含半胱氨酸的LIM结构域，具有协调细胞内外途径中蛋白质相互作用的功能。近些年，TES在头颈鳞状细胞癌、卵巢癌、原发胃癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中均被报道为一个候选抑癌基因。而且越来越多的研究证明启动子CpG岛高甲基化是导致抑癌基因沉默的一个重要机制，包括TES基因。虽然在卵巢癌和原发胃癌中报道杂合性缺失也能引起TES蛋白表达下调或缺失，但是在其他肿瘤中报道高甲基化是导致TES表达沉默的主要机制。Mueller等人发现在原发性胶质瘤中TES高甲基化占58％。虽然在其他肿瘤中报道了TES的抗癌作用，但是在GBM中未见这样的报道。因此我们通过体外功能试验来研究TES在GBM中的作用。此外，我们还对TES甲基化状态与病人的预后做了相关性分析，以期望发现GBM新的预后分子。　　方法:1，提取DNA:从冰冻组织提取基因组DNA，完全按照QIAamp DNA Mini Kit的步骤。提取的DNA浓度及纯度的测定使用NanoDropND-1000spectrophotometer。2，基因组DNA甲基化分析:用甲基化芯片分析42例GBM标本（33例原发和9例继发）。我们使用的甲基化芯片是Illumina Infmium Human Methylation27 Bead-Chips。该芯片可检测27578个CpG位点，覆盖约14000多个有参考序列的基因。基因组DNA亚硫酸钠修饰、芯片处理及数据分析完全按照人类基因组学实验室遗传学威康信托中心的步骤。3，体外功能试验:用5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶处理U87和U251细胞，观察细胞生物学行为变化。用RT-PCR法检测TESmRNA的表达，用Western印迹检测TES蛋白表达以及用MTT法测定药物作用前后胶质瘤细胞的增殖能力。4，分析TES甲基化状态与病人预后的相关性。5，统计学处理:基因芯片显著性分析33例pGBM和9例sGBM甲基化差异基因，Cox回归分析使用Matleb2009b软件。累计生存率用Kaplan-Meier法计算，Log-rank检验。所有统计分析由GraphPadPrism和SPSS16.0软件包完成。以p＜0.05为差异有统计学意义。　　结果:1，通过SAM方法来对甲基化数据进行统计，筛选出pGBM和sGBM中甲基化有差异的基因有136个。然后对这些pGBM进行Cox回归分析，筛选出既与GBM级别相关又与预后相关的基因有8个(WNT7B，CKMT2，AMT，UNQ467，DEFA1，TUBA2，TES，UBQLN3)。我们将TES作为研究目标。pGBM的TES甲基化要高于sGBM，而且TES高甲基化病人的预后差。2，U87和U251细胞经5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶处理后，TES的mRNA和蛋白表达水平均上调。3，经5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶处理后，U87和U251细胞的生长均受到抑制。4，Kaplan-Meier生存曲线分析，TES高甲基化病人的预后差。　　结论:TES在GBM中处于高甲基化状态，尤其在pGBM高甲基化更为明显。用5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶处理U87和U251后，细胞生长受到明显抑制。经去甲基化处理后，TES的mRNA和蛋白表达均恢复。因此我们认为TES的高甲基化影响了该蛋白表达。此外，我们首次发现TES甲基化与胶质瘤病人预后有明显相关性，因此我们推断TES有可能作为GBM的一个预后分子。建议在GBM中对TES做进一步的研究。　　第二部分，DNMT1突变及蛋白表达水平的检测　　背景和目的:胶质瘤是成人中最常见的脑肿瘤。即使采用手术切除及放化疗联合治疗，病人的预后依然很差。胶质瘤和其他肿瘤一样，均是源于复杂的遗传学和表遗传学机制的改变。DNA甲基化异常是最常见的一种表遗传学改变。DNA甲基化是由DNA甲基化酶家族完成的。参与甲基化作用的酶有DNMT1，DNMT3a和DNMT3b。其中，DNMT1是含量最多、最重要的DNA甲基化转移酶，具有维持甲基化的作用。如果DNMT的功能被破环了，那么引起的DNA甲基化异常会导致基因组不稳定从而导致肿瘤发生。最近的研究发现:在肿瘤组织及细胞中DNMT1蛋白表达水平均增高以及在结肠癌中存在DNMT1基因突变。但是迄今为止，并没有关于胶质瘤中检测DNMT1突变及蛋白表达水平的报道。因此我们的研究是为了发现胶质瘤发生过程中DNMT1蛋白表达及基因突变的重要变化，从而为胶质瘤DNA甲基化异常分子机制的研究提供理论基础。　　方法:为了检测胶质瘤中是否存在DNMT1突变，我们对29例胶质瘤标本进行RT-PCR反应并直接测序。对7例正常脑组织标本进行基因组DNA外显子测序，检测DNMT1突变是否是肿瘤特异性的。此外，又对胶质瘤标本进行免疫组化检测蛋白表达水平。　　结果:1，通过对29例胶质瘤标本进行测序比对后发现以下改变:有23例在基因组序列32384位置发生了A→G的点突变，且发生了氨基酸的改变（异亮氨酸-缬氨酸）;所有的标本在基因组序列38679位置和40444位置发生了A→G的点突变，2例在基因组序列32401位置发生了C→T的点突变，但这些突变没有氨基酸的改变，考虑为基因多态性。2，对胶质瘤细胞系U87、U251和LN229进行了RT-PCR并测序比对，发现只有LN229细胞系发生了基因组序列32384位置A→G的点突变，而U87、U251并没有发生这个点突变。3，对7例正常脑组织标本进行基因组DNA测序，发现有3例发生了32384位置A→G的点突变，有4例没有发生A→G的点突变。4，WesternBlot检测各肿瘤细胞系DNMT1的表达呈现不均一性。5，免疫组织化学方法检测低级别胶质瘤和高级别胶质瘤DNMT1表达量不同，摸索好了免疫组化条件，可以进行大批量标本的检测。　　结论:胶质瘤组织中存在氨基酸改变的点突变，为了研究这个点突变是否是肿瘤特异性的，还需要在更多的正常脑组织标本中进行检测，而且需要体外功能实验来证明这个突变是否具有功能。此外我们实验室研究生制备出高质量的DNMT1单克隆抗体，证明可用于WesternBlot和免疫组化实验检测DNMT1的表达，而且我们摸索好了免疫组化的实验条件，为我们后续研究DNMT1在胶质瘤中的表达异常及其分子机制奠定了基础。