动植物在自然生长过程中难免会遭受生物和非生物胁迫。在这些胁迫条件下,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的爆发是植物做出的最快应激反应。其中,1O2是植物光合作用过程中不可避免的副产物,尤其是在叶绿体中1O2被认为是最主要的ROS种类。然而,因1O2活性高,寿命短,同时很难将其同其它种类ROS分离开来,过去对其研究相对较少。直到条件突变体flu的出现,使得单独对1O2进行研究成为可能。前人研究表明,flu中O2的产生能够引起植株生长停滞、细胞死亡和整株伤害,而且证实这些伤害是由两个核编码的叶绿体同源蛋白EXECUTER(EX1和EX2)介导的,与1O2的直接氧化毒性无关。链格抱菌(Alternaria alternata)是自然界中三大致病植物真菌之一,其产生的毒素-细交链抱菌酮酸(Tenuazonic Acid,简称TeA)被证实能够激活拟南芥幼苗中1O2介导EX蛋白依赖的信号途径。其主要作用机理是通过与光系统II的D1蛋白结合,抑制光系统II受体侧QA到QB之间光合电子的传递,引起过能量化,导致叶绿体中活性氧爆发,造成叶绿体结构破坏。TeA在较低的浓度下能够迅速杀死紫茎泽兰以及其它多数单双子叶杂草,具有开发成生物除草剂的潜力。TeA可以激活拟南芥幼苗中的1O2介导EX蛋白依赖的信号,那么分泌毒素TeA的链格抱菌也可能激活拟南芥成熟植株中的1O2介导EX蛋白依赖的信号。本论文主要利用野生型链格孢菌侵染拟南齐flu和flulexlex2以及拟南芥Co1-0和exlex2成熟植株,探究1O2介导EX蛋白依赖的信号是否参入了链格抱菌与拟南芥成熟植株的相互作用过程。利用野生型链格抱菌孢子悬浮液为材料接种侵染拟南芥flu和fulexlex2,结果表明孢子悬浮液处理对拟南芥flu造成的组织伤害严重于flu/exlex2,两者存在显著性差异。TBD染色结果显示flu在侵染后48 h即出现了细胞死亡,随着诱导时间的增加,蓝色的面积扩大并且深度加深,说明细胞死亡在增加。而flu/exlex2直到144 h才有局部被染成蓝色即细胞死亡。102标记基因在侵染后出现了上调,并且突变体flu/exlex2中上调幅度显著小于flu中相应的标记基因。孢子侵染拟南芥,首先需要萌发长出菌丝,而用含有菌丝的菌饼可以加快侵染速度。菌饼的侵染结果与孢子悬浮液侵染结果一致,并且病斑更大,出现时间更早。以Oh为对照,测得菌饼处理48h后flu的电导率增加到4.3倍,显著大于flu/ex/ex2的1.4倍。综合这些结果说明链格抱菌侵染拟南芥成熟植株后,细胞内1O2产生量明显增加,1O2介导EX蛋白依赖的信号参入了链格孢菌引起拟南芥flu成熟植株病害过程。利用野生型链格抱菌菌饼为材料接种侵染寄主拟南芥Col-0和突变体exlex2成熟植株活体叶片,结果表明菌饼处理对拟南芥Col-0造成的组织伤害严重于exlex2,两者存在显著性差异。以0 h为对照,测得菌饼处理48 h后Col-0的电导率增加到3.4倍,显著大于exlex2的1.7倍。TBD染色结果显示,Col-0在侵染12h后即出现细胞死亡,而突变体exlex2虽也在12 h出现细胞死亡,但相应时间点细胞死亡的程度exlex2都要轻于Col-0;Imaging-PAM荧光图像显示,Col-0在侵染后12h光合作用活性即受到了影响,随着诱导时间增加,这种伤害不断增强,突变体exlex2虽在侵染后12 h也表现出症状,但相应时间点受损害的程度exlex2都要显著低于Col-0;荧光参数Fv/Fm、ETR值的变化也反应了这种趋势;1O2标记基因的荧光定量结果显示,6 h后相关基因在Col-0中上调的幅度和速度都要明显的高于突变体exlex2,并且过氧化氢标记基因的表达水平在两者之间没有明显差异,说明在侵染过程中是102在发挥主要作用。结合这些结果说明,102介导EX蛋白依赖的信号参入了链格孢菌诱导拟南芥成熟植株病害过程。先将拟南芥Col-0和exlex2成熟植株放入低温光强为(600 μmol.m-2s-1 12 ℃)的培养箱中预处理24h,再在生长条件(100μmol.m-2s-1,22 ℃)下恢复12h,然后用野生型链格抱菌菌饼(3mm)进行侵染。结果显示,经过预处理后,拟南芥Col-0形成的病斑明显小于没有预处理的Col-0。以0 h为对照,测得菌饼处理48 h后没有经预处理的实验组中Col-0的电导率增加到3.4倍,显著大于exlex2的1.7倍,有经预处理的实验组中Col-0的电导率增加1.3倍,exlex2也增加到1.3倍。高光低温预处理显著降低了 Col-0中的细胞死亡率。并且Col-0和exlex2中单线态氧标记基因上调幅度明显小于没有预处理的,而且Col-0中的标记基因下降幅度显著大于exlex2中相应基因的下降幅度。这些结果说明高光低温预处理能够激活拟南芥Col-0细胞内EX蛋白依赖的1O2信号,对随后的病原菌处理产生了明显的抗性;而缺乏EX蛋白的exlex2植株不能激活1O2信号途径,对病原菌诱导的1O2无法产生适应。这进一步证实102介导EX蛋白依赖的信号参入了链格孢菌诱导拟南芥成熟植株的病害过程。利用野生型链格孢菌菌饼为材料,接种侵染拟南芥Col-0和突变体eds1成熟植株活体叶片,结果表明菌饼处理对拟南芥edsl造成的组织伤害严重于Col-0,两者存在显著性差异。TBD染色结果显示,edsl和Col-0在12 h都出现了细胞死亡,但相应时间点eds1细胞死亡的程度都要严重于Col-0;Imaging-PAM荧光图像显示,edsl和Col-0在侵染后12 h光合作用活性都受到了影响,随着诱导时间增加,这种伤害不断增强,并且相应时间点eds1受损害的程度都要显著严重于Col-0;荧光参数Fv/Fm、ETR值的变化也反应了这种趋势;1O2标记基因的荧光定量结果显示,侵染6 h后相关基因在eds1中上调的幅度和速度都要明显的高于Col-0,并且过氧化氢标记基因的表达水平在两者之间没有明显差异,说明在侵染过程中是单线态氧在发挥主要作用。对于突变体eds1上病斑形成的作用机理以及eds1在这过程中的作用有待于进一步的研究。本研究证明了 1O2介导EX蛋白依赖的信号途径参入了链格孢菌诱导拟南芥成熟植株的病害过程。