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背景:心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段,随着世界人口老龄化,心力衰竭已经成为严重的公共卫生问题。高血压目前被认为是导致心力衰竭的主要原因之一,持续的高血压可导致心脏发生一系列病理变化,包括心肌细胞肥大、心脏组织纤维化等,最终发生心力衰竭。在心力衰竭的发生发展中,血管新生对维持心功能起重要作用。人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）具有很强的分化能力,目前已经被认为在修复心脏损伤方面极具潜能。然而,人胚胎干细胞应用仍存在许多问题,例如引发机体免疫反应、移植存活率低等,导致其临床应用受限。既往研究发现,干细胞对心脏的修复作用主要源于旁分泌机制。人胚胎干细胞来源的外泌体（hESCs derivedexosomes,hESC-exo）作为干细胞主要的分泌性囊泡,可通过携带的microRNA和蛋白质等发挥生物效应。目前,外泌体已经成为治疗心力衰竭极具前景的研究方向之一。第一部分 人胚胎干细胞的培养、鉴定以及外泌体的提取、鉴定和蛋白质谱分析第一节 人胚胎干细胞的培养和鉴定目的:对H9人胚胎干细胞进行培养并确定细胞状态。方法:配置完全的Essential 8培养基,使用Vitronectin蛋白包被细胞培养器材,对H9人胚胎干细胞进行传代培养,采用电子显微经观察细胞形态并进行碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase,ALP）鉴定培养结果。结果:培养的人胚胎干细胞生长良好,ALP染色证实干细胞处于未分化状态。结论:人胚胎干细胞使用Essential 8联合Vitronectin蛋白培养系统培养效果良好,能保持干细胞的未分化状态。第二节 人胚胎干细胞外泌体的提取、鉴定和蛋白质谱分析目的:从人胚胎干细胞培养基中抽提外泌体并进行鉴定,使用蛋白质谱分析及Western Blot明确外泌体含有的蛋白成分。方法:采用超速离心法从细胞培养上清中提取外泌体（exosome）。使用纳米流式技术（nano flow cytometry,NanoFCM）对外泌体进行粒径检测;投射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）观察外泌体的大小及形态;Western Blot 鉴定外泌体标记分子CD9及Alix。对提取的外泌体进行蛋白质谱分析并采用Western Blot验证。结果:1.人胚胎干细胞培养基抽提的外泌体直径范围在50-125nm,平均直径66.66nm,直径中位数61.75nm,大小相对均一;电镜下显示具有特征性的外泌体球形结构;Western Blot检测到外泌体标记分子CD9+,Alix+。2.蛋白质谱分析结果显示外泌体富含多种蛋白质,其中低分子量成纤维细胞生长因子 2（fibroblastgrowth factor2,FGF2）位于蛋白质含量的前 10 位,Western Blot证实外泌体内所含FGF2分子量为18kDa。结论:使用超速离心法可有效从人胚胎干细胞培养基中抽提出分泌性囊泡,经电镜、纳米流式技术及Western Blot检测,证实为外泌体。对外泌体进行蛋白成分分析显示外泌体内富含低分子量FGF2。第二部分 hESC-exo通过FGF2促进血管内皮细胞体外形成血管样结构目的:明确hESC-exo对血管内皮细胞的作用及调控机制方法:选取人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）为研究对象,使用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染48小时抑制HUVECs 成纤维细胞生长因子 2 受体（fibroblastgrowthfactor2 receptor,FGF2R）的表达。将HUVECs分为对照组、FGF2处理组、exosome处理组及FGF2R siRNA+exosome 处理组。FGF2 处理组加入 FGF2（10ng/ml）;exosome 处理组及 FGF2R siRNA+exosome处理组加入hESC-exo（1×109）。分别培养6小时,检测各组内皮细胞的小管形成能力。结果:1.使用FGF2R siRNA干扰后,FGF2R相对表达量下降约60%（1.00±0.14 VS 0.30±0.10,P＜0.01）2.与对照组相比,FGF2处理组及exosome处理组内皮细胞的成管长度增加约1倍（0.92±0.08 VS 2.18±0.18,P＜0.01;0.92±0.08 VS 1.83±0.06,P＜0.01）。3.抑制FGF2R的表达后,外泌体诱导内皮细胞的成管长度的下降近50%（1.83±0.06VS 1.05±0.17,P＜0.01）。结论:hESC-exo通过含有的FGF2增强内皮细胞体外形成血管样结构的能力第三部分 hESC-exo治疗压力负荷诱导的心力衰竭小鼠的机制研究目的:使用hESC-exo治疗压力负荷诱导的心力衰竭小鼠,观察hESC-exo对心功能的影响,并探索相关调控机制方法:选用8周龄C57BL/6雄性小鼠共36只。使用主动脉缩窄构建心力衰竭小鼠模型（n=30）,对照组小鼠予以假手术治疗（对照组,n=6）。4周后将心力衰竭模型小鼠进行分组,分别为心力衰竭组、hESC-exo处理组及hESC-exo+AZD4547处理组（n=10）。对所有小鼠连续尾静脉注射6周,每周3次。hESC-exo处理组每次注射3×1010外泌体;hESC-exo+AZD4547处理组在注射hESC-exo的同时予以腹腔注射AZD4547（2mg/kg）;对照组及心力衰竭组注射同等体积的生理盐水（NS）。经尾静脉注射的hESC-exo采用CM-Dil染料染色。10周后使用心脏超声评估心功能,处死小鼠后取心脏组织切片,分别进行麦胚凝集素（WGA）染色,Masson’s染色,CD31免疫荧光染色。结果:1.尾静脉注射hESC-exo后行心脏组织切片可观察到被心脏组织摄取的hESC-exo。2.主动脉缩窄10周后,心力衰竭动物模型构建成功:与对照组相比,心力衰竭组小鼠 LVEF 明显下降（65.68±5.73 VS 37.27±4.72,P＜0.01）,LVFS 明显下降（36.20±4.71 VS 17.97±2.61,P＜0.01）,LVIDS 明显增加（2.65±0.47VS 3.80±0.08,P＜0.01）,LVIDD 明显增加（4.03±0.34VS 4.63±0.14,P＜0.01）。3.使用hESC-exo治疗后心力衰竭小鼠的心功能明显改善:与心力衰竭组相比,hESC-exo 处理组 LVEF 和 LVFS 明显上升（37.27±4.72 VS 49.80±5.43,P＜0.01;17.97±2.61 VS 25.20±3.44,P＜0.01）;LVIDS 和 LVIDD 明显下降（3.80±0.08 VS 3.17±0.29,P＜0.01;4.63±0.14VS 4.21±0.27,P＜0.05）。4.FGF2R阻断剂AZD4547可以逆转hESC-exo对心力衰竭的保护作用:与hESC-exo处理组相比,hESC-exo+AZD4547处理组LVEF和LVFS明显下降（49.80±5.43 VS 37.09±2.99,P＜0.01;25.20±3.44 VS 17.80±1.72,P＜0.01）,LVIDS 明显上升（3.17±0.29VS 3.77±0.30,P＜0.05）,LVIDD 无明显变化（4.21±0.27VS 4.63±0.37,P＞0.05）。5.WGA及Masson’s染色显示,hESC-exo治疗对心力衰竭小鼠心肌细胞面积及心脏纤维化程度无影响。6.CD31荧光染色显示:与对照组相比,心力衰竭组微血管密度下降约40%（0.85±0.07VS0.50±0.04,P＜0.01）。与心力衰竭组相比,经尾静脉注射hESC-exo可以增加微血管密度约 70%（0.50±0.04 VS 0.86±0.07,P＜0.01）。使用 AZD4547 阻断FGF2R 后,hESC-exo 促进血管新生的作用下降约 40%（0.86±0.07VS 0.54±0.07,P＜0.01）结论:hESC-exo通过FGF2-FGF2R途径促进血管生成改善心力衰竭模型小鼠的心脏功能。