Na/K泵(Na/K pump,NKP)是普遍存在于细胞膜上的一种酶,它属于P型ATP酶家族。Na/K泵可以逆浓度梯度转运3个钠离子和2个钾离子,同时消耗1分子的ATP。此外,它还可以作为转运其他溶质、氨基酸、盐类和磷酸盐等的驱动力。这种非等值的转运是一个生电的过程,并且产生一个跨膜的电位进而引起细胞的兴奋。在许多临床疾病的发生过程中都伴随着Na/K泵的活性的改变,例如高血压,糖尿病和其他疾病。因此,Na/K泵活性调节机制的阐明变得至关重要。　　 肾上腺素受体可以调节Na/K泵活性,其分为两种亚型,即α-和β-肾上腺素受体,二者均可调节Na/K泵的活性,并且这种调节包括短时程作用和长时程作用,但其分子机制仍不清楚。Na/K泵短时程和长时程调节机制的阐明对分析细胞、组织对激素的适应性以及生物体电解质的状况都是必需的,同时,对由于Na/K泵功能紊乱所致疾病的治疗也是至关重要的。本实验主要探讨了肾上腺素受体的短时程和长时程激活对Na/K泵活性的影响及其相关机制。　　 目的:众多因素对Na/K泵的调节可分为短时程和长时程调节,本研究旨在探讨肾上腺素受体激活对大鼠心肌细胞Na/K泵的调节及其机制。　　 方法:(1)心肌细胞的急性分离:酶解法急性分离SD大鼠心肌细胞,并保存在KB溶液中。然后,分别短时程(10min)和长时程(24h)室温下孵育去甲肾上腺素(NA)(共孵育普萘洛尔,以阻断β-肾上腺素受体)和异丙肾上腺素(ISO)。　　 (2)Na/K泵电流的测定:应用全细胞膜片钳技术观察细胞膜电流以检测α-和β-肾上腺素受体激动剂对Na/K泵电流(Ip)的影响。　　 (3)全细胞蛋白、质膜蛋白和内体的提取:用药品孵育急性分离的心肌细胞,然后用冷的裂解液裂解以获得全细胞蛋白。按照细胞表面蛋白分离试剂盒(Thermo)的说明提取细胞质膜蛋白。应用蔗糖梯度的方法提取早期内体(EE)和晚期内体(LE)。BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。　　 (4)蛋白免疫印迹:用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白后电转移至PVDF膜上,然后用TBST溶解的5％脱脂奶粉37℃下封闭1小时。一抗是Na/K泵α1亚基抗体(Santa,1:500)和α2亚基抗体(Upstate,1:200)。辣根过氧化物酶标记的抗鼠和抗兔抗体(KPL,1:1000)作为二抗。用增强型化学发光的方法对印迹条带进行曝光。　　 (5)mRNA的提取:依照Promege SV总RNA分离系统试剂盒的说明从大鼠心肌细胞上提取总RNA。　　 (6)反转录聚合酶链反应(RT-PCR):应用Na/K泵α1和α2亚基的特异性引物,通过PCR技术扩增反转录产物(cDNA)。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行分离,并用GoldViewⅡ进行核酸染色。　　 (7)实时定量PCR对特异cDNA的定量:选择GAPDH作为管家基因。对Na/K泵α1和β2亚基以及GAPDH同时进行实时定量PCR。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行分析。　　 结果:　　 (1)短时程激活肾上腺素受体可以以亚基特异性的方式影响Na/K泵电流(Ip)。α-肾上腺素受体(α-AR)的激活通过与Na/K泵α2亚基相偶联升高高亲和力泵电流(Ih),不影响由Na/K泵α1亚基引起的低亲和力泵电流(I1);β-肾上腺素受体(β-AR)的激活通过与Na/K泵α1亚基相偶联降低I1,对由α2亚基引起的Ih没有影响。　　 (2)无论是α-还是β-肾上腺素受体,短时程激活均不影响Na/K泵α亚基的mRNA水平和全细胞蛋白含量。　　 (3)α-肾上腺素受体短时程激活可增加细胞质膜上Na/K泵α2亚基蛋白含量,不影响α1亚基蛋白含量;而β-肾上腺素受体短时程激活可降低质膜上Na/K泵α1亚基蛋白含量,不影响α2亚基蛋白含量。　　 (4)α-和β-肾上腺素受体短时程激活对Na/K泵的作用可被能阻止质膜上Na/K泵α亚基转位的鬼笔环肽取消。　　 (5)α-肾上腺素受体短时程激活通过PKC通路对Na/K泵活性进行调节,β-肾上腺素受体短时程激活通过PKA通路对Na/K泵活性进行调节。　　 (6)肾上腺素受体长时程激活对Na/K泵电流密度的调节亦是以亚基特异性的方式进行的。α-肾上腺素受体的长时程激活通过与Na/K泵α2亚基相偶联降低Ih密度,不影响由Na/K泵伍α1亚基引起的I1密度;β-肾上腺素受体的激活通过与Na/K泵α1亚基相偶联升高I1密度,对由α2亚基引起的Ih密度没有影响。　　 (7)α-肾上腺素受体长时程激活可以减少Na/K泵α2亚基的蛋白表达,不影响α1亚基;β-肾上腺素受体长时程激活可以增加Na/K泵α1亚基的蛋白表达,不影响α2亚基。　　 (8)α-肾上腺素受体长时程激活可以降低Na/K泵α2亚基的mRNA水平,不影响α1亚基;β-肾上腺素受体长时程激活可以升高Na/K泵α1亚基的mRNA水平,不影响α2亚基。　　 (9)α-肾上腺素受体长时程激活通过PKC通路对Na/K泵活性进行调节,β-肾上腺素受体长时程激活通过PKA通路对Na/K泵活性进行调节。　　 结论:无论短时程或长时程激活α-AR和β-AR,均可亚基特异性调节大鼠心肌细胞Na/K泵活性,其中α-AR激活与Na/K泵α2亚基偶联,经PKC通路调节高亲和力Na/K泵活性,β-AR激活与Na/K泵α1亚基偶联,经PKA通路调节低亲和力Na/K泵活性;无论α-AR或β-AR,长时程激活对Na/K泵活性的影响均与短时程激活时相反,且短时程激活时均与其相应α-亚基在细胞膜上的转位有关,而长时程激活时均与其相应α-亚基的蛋白表达和mRNA表达水平改变有关。