研究背景:关节骨软骨组织是人体关节重要的负重组织,关节疾病及创伤导致的关节骨软骨损伤十分常见,是导致关节疼痛、功能障碍甚至肢体残疾的主要疾病,给病人及社会带来了沉重的负担。Curl等回顾性分析了31516例行膝关节镜手术的患者,63%的患者发现有软骨损伤。由于透明软骨组织无血液供应,缺乏祖细胞聚集途径,一旦损伤,难以自身修复。现有的临床治疗策略包括:保守治疗、关节腔清理术、微骨折术、软骨细胞移植、自体或异体骨软骨移植及人工关节置换等技术,但以上治疗策略均存在有明显的缺陷,长期治疗效果难以令人满意。目前常用的治疗策略以微骨折术为代表,它通过破坏钙化软骨层结构,使得软骨缺损由血凝块所填充,而该血凝块中富含骨髓来源的间充质干细胞,间充质干细胞进入骨软骨缺损区增殖并分化为纤维软骨细胞,刺激骨软骨缺损区域纤维软骨修复。以达到缓解症状,填充缺损,延缓OA的发生等作用,但其远期疗效欠佳。而骨软骨移植及软骨细胞移植由于组织、细胞来源有限,且会造成供区损伤,制约了其应用。人工关节置换术创伤较大,适用于严重的关节骨软骨损伤或终末期关节疾病软骨大量破坏的情况下,术后并发症及假体长期生存率仍有待提高。组织工程骨软骨技术是以再生医学方式治疗关节骨软骨损伤最为理想的新方法。但现阶段工程化的骨软骨组织与宿主组织整合较差、存在纤维软骨样退变、力学性能较低下,难以确保其治疗关节骨软骨损伤的长期有效性。我们认为导致以上现象的主要原因是现阶段构建的工程化骨软骨组织在结构和功能上都存在有明显的缺陷,特别是缺少透明软骨层与软骨下骨层之间的界层连接结构,即:钙化软骨层结构。钙化软骨层是介于透明软骨层与软骨下骨层之间的界层连接结构,通过上方的波浪形潮线结构及下方的不规则粘合线结构与透明软骨层及软骨下骨层紧密铆合[1]。钙化软骨层由大量的有机胶原纤维及无机矿物质组成,其结构致密,平均厚度为104.16±20.87μm,在物质通透及力学传导等方面发挥重要功能。研究发现钙化软骨层具有隔离带的作用,其隔离带作用具有阻止成骨性和成软骨性细胞相互迁移,使其于特定区域增殖并定向分化,为成骨和成软骨提供独立的生长微环境。在骨关节炎病理发病过程的早期可观察到钙化软骨层发生穿孔,并伴有血管、神经的长入及通透性的改变,同时潮线发生复制及漂移等现象。因此在骨软骨组织工程研究中,构建出含致密钙化软骨层结构的复合支架可能具有重要意义。因此,在对钙化软骨层的形态结构及生理功能认识的基础上,我们提出了一体化构建包括透明软骨层、钙化软骨层及软骨下骨层的三层仿生骨软骨支架的新理念。利用脱细胞骨支架复合Ⅱ型胶原蛋白水凝胶,采用冻干交联的方法制备含天然钙化层结构的仿生型骨软骨支架。一体化构建就是在支架制备的过程中使软骨支架与骨支架直接结合成整体。同时,为了给软骨层及软骨下骨层提供独立的培养微环境,我们在构建的含天然钙化层结构的仿生型骨软骨支架的基础上,以聚乳酸(Polylactic acid,PLA)为原材料,运用计算机辅助设计(Computer aided design,CAD)技术及三维打印快速成型技术(3DP)构建了双室培养系统。为验证该双室培养系统的可行性,并进一步证明钙化软骨层的隔离带作用。我们以人羊膜间充质干细胞为种子细胞,接种于含天然钙化层结构的仿生型骨软骨支架上,并通过双室培养系统为软骨层及软骨下骨层提供成软骨及成骨诱导培养基。通过细胞示踪技术、组织切片技术、PCR技术等实验手段检测种子细胞在支架内的粘附、增殖、分化及迁移等生物学行为。最后,我们选取实验动物进行骨软骨缺损造模,使用经双室培养后的含种子细胞的骨软骨支架植入该骨软骨缺损,观察该仿生型骨软骨支架在修复骨软骨缺损中的作用,并与空白对照及不含钙化层骨软骨支架的修复效果相对比。第一部分含天然钙化软骨层仿生组织工程骨软骨支架的制备及检测本部分研究中,我们钻取正常猪膝关节股骨髁负重面骨软骨柱,削去骨柱透明软骨部分。切下的透明软骨用于Ⅱ型胶原蛋白提取,而含钙化软骨层的软骨下骨柱行脱细胞处理。然后将提取的Ⅱ型胶原蛋白水凝胶接种于钙化层之上,经过冻干及交联等步骤,获得含天然钙化层的仿生骨软骨支架,并对支架相关特性进行检测。一、实验方法1.含天然钙化软骨层骨柱的制备及检测(1)钻取直径为12 mm的含有天然钙化软骨层结构的骨柱,削去透明软骨层;(2)Triton X-100脱去骨柱中的细胞;(3)HE染色及DAPI染色观察骨柱中细胞是否洗脱干净。2.Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的制备(1)获取透明软骨粉;(2)胃蛋白酶消化,盐析及透析。3.骨软骨支架的制备及检测(1)三维打印构建骨软骨支架制备模具;(2)通过模具在脱细胞骨支架上灌注Ⅱ型胶原蛋白水凝胶,再通过冻干、交联等步骤制备骨软骨支架;(3)检测支架孔隙率、孔径、细胞毒性及结构特征。二、实验结果构建的骨软骨支架呈深蓝色,细胞洗脱彻底,Ⅱ型胶原蛋白海绵支架平均孔隙率为(96.1±3.8)%,扫描电镜下测其孔径平均大小为(102.3±35.3)μm,脱细胞软骨下骨支架的平均孔隙率为(73.5±2.6)%,其平均孔径大小为(470.2±158.8)μm,呈多孔网状结构,孔隙结构良好,孔孔相通。支架浸提液对细胞生长无明显影响。第二部分含天然钙化软骨层仿生支架双室培养系统的构建本部分研究中,为了给软骨层及软骨下骨层提供独立的培养微环境,我们设计了基于钙化软骨层的双室培养系统,利用钙化软骨层的隔离带作用,为软骨腔及软骨下骨腔分别提供成软骨及成骨培养基。在成软骨及成骨的环境中,诱导间充质干细胞分别向软骨细胞及成骨细胞的方向分化。这种双室培养系统更加符合骨软骨组织的生理特征,因此可能构建出更加仿生的骨软骨缺损修复材料。一、实验方法1.双室培养装置的构建(1)运用计算机辅助设计技术设计双室培养系统的计算机三维模型;(2)运用三维打印技术制备双室培养系统各部件;(3)组装双室培养系统,并进行密闭性测试,Co60辐照灭菌。2.人羊膜间充质干细胞培养I型胶原酶消化法获取人羊膜间充质干细胞,差速消化法进行纯化。3.人羊膜间充质干细胞复合支架共培养(1)CFDA SE及Di I标记人羊膜间充质干细胞;(2)细胞悬液接种法及凝胶接种法接种CFDA SE标记的细胞于胶原层,Di I标记的细胞于软骨下骨层,并进行双室培养;(3)通过病理切片、荧光定量PCR、支架总DNA含量检测等手段,检测支架中细胞粘附、生长、增殖、分布及分化情况。二、实验结果双室培养7天后,荧光显微镜下可观察到胶原层CFDA SE标记的绿色荧光细胞,软骨下骨层Di I标记的红色荧光细胞,绿色荧光细胞与红色荧光细胞分别位于钙化软骨层两边,无跨钙化层细胞迁移现象。荧光定量PCR检测胶原层内种子细胞的成软骨标志物随培养时间延长而逐渐增加,软骨下骨层内种子细胞的成骨标志物随培养时间延长而逐渐增加。支架中种子细胞总DNA含量随着培养时间的延长而逐渐增加,因此表明随着双室培养时间的延长,支架内种子细胞的数量逐渐增加。第三部分骨软骨支架动物实验在前面的研究基础上,为了进一步验证该含天然钙化层仿生骨软骨支架对关节骨软骨损伤的修复效果。在本部分研究中我们选择贵州小香猪为实验动物,通过手术方法行膝关节股骨髁负重面骨软骨缺损造模。植入经双室培养的含天然钙化层的仿生骨软骨支架,观察其修复效果,并与空白对照及无天然钙化层仿生骨软骨支架的修复效果进行对比。一、实验方法1.含天然钙化层仿生骨软骨支架双室培养(1)Percoll密度梯度离心法获取猪BMSCs;(2)复合支架进行双室培养。2.骨软骨缺损造模及修复(1)30头贵州小香猪随机分为3组,每组20膝,共60膝;(2)造模,A组为空白对照组(单纯骨软骨缺损);B组为不含钙化层骨软骨支架修复组;C组为含天然钙化软骨层骨软骨支架修复组;3.修复效果评估体视显微镜观察,核磁共振检查,HE染色,固绿—番红O染色,天狼星红染色及O’Driscoll组织学评分评估骨软骨缺损修复效果。二、实验结果与空白对照及不含钙化层骨软骨支架相比,含天然钙化软骨层骨软骨支架在修复骨软骨缺损中具有良好的修复效果。含天然钙化软骨层骨软骨支架修复组中软骨下骨层修复组织与宿主组织无明显差异,可见完整的钙化软骨层结构。但软骨缺损部位仍有部分凹陷,修复组织表面并未与关节表面平齐。结论:通过低温冻干及京尼平交联技术,利用含天然钙化软骨层脱细胞骨基质及II型胶原蛋白水凝胶可构建出含完整钙化层结构的三层仿生骨软骨支架,该支架结构良好,无明显细胞毒性。其钙化软骨层具有生理性隔离带作用,利用其生理性隔离带作用,我们构建的双室培养系统能为软骨层及软骨下骨层提供独立的生长微环境。种子细胞在含天然钙化软骨层骨软骨支架中生长良好,在诱导分化培养基的作用下,软骨层及软骨下骨层中的间充质干细胞可分别向成软骨及成骨方向分化,且随着培养时间的延长,支架内种子细胞含量逐渐增加。在骨软骨缺损修复实验中,与空白对照及不含钙化层骨软骨支架相比,含天然钙化软骨层的骨软骨支架在修复骨软骨缺损中具有良好的修复效果,其修复组织结构及成分与正常骨软骨组织类似。