GRP75(Glucose-Regulated Protein75)蛋白属于热休克蛋白mtHsp70家族成员，主要定位于线粒体基质中还有一部分GRP75蛋白位于细胞质基质以及细胞质基质的囊泡中。GRP75蛋白能够协助约有20％线粒体内的蛋白进入到线粒体中，帮助进入线粒体内的未折叠蛋白折叠成正确的构象，同时GRP75蛋白还能够协助错误蛋白折叠成形成正确的蛋白构象以及损伤蛋白的降解。现阶段对于GRP75蛋白的研究主要集中在GRP75蛋白与细胞的抗应激反应上的功能研究，但是对于GRP75蛋白与代谢性疾病尤其是细胞胰岛素抵抗之间的关系研究现在还是空白状态。因而，研究GRP75蛋白是如何参与细胞产生胰岛素抵抗的机制有着十分重要的意义。通过高脂喂养制造的胰岛素抵抗的小鼠模型中我们发现在小鼠的肝脏和脂肪细胞中GRP75蛋白的表达量呈下降趋势，通过这个结果可以初步看出GRP75蛋白与胰岛素抵抗之间存在着一定的关系。在3T3-L1及C2C12细胞中构建了GRP75KD(Knock Down)的细胞模型之后对其进行功能的检测，发现GRP75KD的细胞产生了胰岛素抵抗的现象。这进一步证实了GRP75蛋白与细胞产生胰岛素抵抗之间存在着直接的关系。　　目的:　　1.通过对胰岛素抵抗小鼠细胞模型中的肝脏和脂肪及骨骼肌组织进行WB(Western Blot)检测，检测脂肪组织和肝脏组织中GRP75蛋白的表达量。　　2.使用RNAi(RNA interference)技术，对3T3-L1和C2C12细胞系进行GRP75蛋白进行稳定敲低，构建稳定的GRP75KD细胞模型。　　3.检测GRP75KD细胞对胰岛素刺激下的葡萄糖吸收水平。　　4.对GRP75KD细胞进行线粒体功能检测，主要检测:线粒体ATP生成能力、膜电位水平、ROS(Reactive Oxygen Species)水平，确定GRP75蛋白是否影响线粒体的功能。　　5.对GRP75KD细胞胰岛素信号通路进行检测，主要检测AKT蛋白的Ser437位点和Thr308位点的磷酸化水平，以及IRS1(Insulin Receptor Substrate1)Ser302和Ser307位点磷酸化水平检测，确定GRP75蛋白敲低之后对胰岛素信号通路的影响。　　6.对GRP75KD细胞中JNK蛋白的磷酸化水平检测，确定GRP75蛋白敲低之后能否提高JNK蛋白的磷酸化水平。　　7.对GRP75KD细胞加入NAC(N-acetyl-L-Cysteine)后，检测细胞的胰岛素信号通路是否得到恢复，JNK蛋白磷酸化水平是否降低。　　方法:　　1.使用life technology公司的RNAi功能模块设计了一条shRNA，通过查找文献确定另外一条shRNA。使用两条shRNA对3T3-L1和C2C12两株细胞进行RNAi。使用嘌呤霉素进行筛选获得多个GRP75成功敲低的细胞克隆。　　2.将GRP75KD细胞培养至覆盖度达到80％之后，检测胰岛素刺激下的葡萄糖吸收水平在对照组及GRP75KD细胞之间的差异。　　3.将GRP75KD细胞培养至覆盖度达到80％时进行线粒体功能的检测，分析GRP75敲低之后线粒体功能与正常对照之间的差异性。　　1)应用TMRM荧光染料检测GRP75KD细胞的膜电位水平。　　2)应用ATP检测试剂盒分析GRP75KD细胞内以及线粒体内的ATP生成能力　　3)应用ROS检测试剂盒GRP75KD细胞线粒体内ROS水平　　4)应用DCFH-DA试剂盒检测GRP75KD细胞内整体ROS水平。　　4.对GRP75KD细胞中的胰岛素信号通路蛋白进行检测，主要检测胰岛素信号通路中的AKT蛋白Ser437位点和Thr308位点的磷酸化水平以及IRS1蛋白Ser302和Ser307位点磷酸化水平检测。　　5.对GRP75蛋白敲低后的细胞的JNK蛋白磷酸化水平的检测，通过WB技术检测确定在GRP75KD细胞与正常对照细胞之间是否存在差异。　　6.通过在GRP75KD细胞中加入NAC(N-乙酰半胱氨酸)后，检测JNK蛋白的磷酸化水平，AKT蛋白以及IRS1蛋白相应位点的磷酸化水平是否发生变化。　　结果和结论:　　1.高脂喂养的胰岛素抵抗小鼠的肝脏和白色脂肪组织中，GRP75蛋白在肝脏组织和肌肉组织中表达量具有显著性的降低。同时IRS1蛋白Ser302位点磷酸化水平降低。　　2.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞，胰岛素刺激下的葡萄糖吸收在 GRP75KD的细胞中较正常细胞有显著性的降低。　　3.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞，细胞内整体的ROS以及线粒体内的ROS水平较对照细胞有显著性的差异。　　4.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞，线粒体的膜电位水平、ATP生成能力均有显著性的下降。　　5.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中，JNK(c-Jun N-terminal Kinase)蛋白的磷酸化水平增加，说明JNK蛋白在GRP75蛋白敲低之后JNK蛋白被活化。　　6.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中，AKT蛋白的Ser437位点和Thr308位点的磷酸化水平水平降低。　　7.GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中，IRS1蛋白的Ser302位点的磷酸化水平降低，Ser307位点的磷酸化水平增加。　　8.通过对GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中加入NAC之后，JNK蛋白的磷酸化水平降低。　　9.通过对GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中加入NAC之后，AKT蛋白的Ser437位点和Thr308位点的磷酸化水平得到了一定程度的回复。　　10.通过对GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中加入NAC之后IRS1蛋白的Ser302位点的磷酸化水平得到一定程度的回复，Ser307位点的磷酸化水平降低。　　11.通过对GRP75KD的3T3-L1细胞和C2C12细胞中加入NAC之后，胰岛素刺激下的葡萄糖吸收在对照组与GRP75KD的细胞之间没有差异。