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糖尿病肾病是糖尿病微血管病变之一,严重影响患者的生活质量,甚至危及患者的生命。探究糖尿病肾病的发生机制及如何延缓糖尿病肾病势在必行。糖尿病肾病的病变特点包括肾小球肥大,细胞外基质(extracellular matrix ECM)增多及异常沉积,不断进展的肾小管间质纤维化以及终末期肾小球硬化。其中,肾间质纤维化是疾病进展的关键环节,以大量的细胞外基质(ECM)聚集为特征。研究表明,转化生长因子β1(transforming growth factor beta-1 TGF-β1)是作用最强的致肾纤维化细胞因子,TGF-β1/Smads信号转导通路介导TGF-β1的致纤维化作用[1]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor CTGF)是TGF-β1的下游因子,可调节成纤维细胞的生长和ECM的分泌,在肾脏纤维化中发挥重要作用[2]。骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7 BMP-7)是TGF-β超家族的亚群之一,具有显著的肾脏保护作用[3]。研究发现BMP-7通过多种途径发挥肾脏保护作用,并且能够抑制TGF-β1/Samds信号转导通路,具有强大的抗纤维化作用,且这一作用是独立于肾脏保护作用的[4]。氧化苦参碱(Oxymatrine OMT),分子式为C15H24N2O,是从中药苦参、苦豆子及广豆根中提取的一种中药单体,药理作用广泛,如抗病毒、抗炎、调节免疫及抗纤维化等作用。我们的前期研究证实:糖尿病肾病模型大鼠肾小球Smad1的表达增加,肾小球系膜内基质集聚,CTGF的含量增加。既往研究发现氧化苦参碱具有改善肾脏纤维化的作用,但氧化苦参碱通过何种机制发挥抗纤维化作用仍不明确,由此我们提出假设,氧化苦参碱是否通过影响细胞外基质积聚来逆转肾脏纤维化呢?本研究拟通过高糖诱导建立大鼠系膜细胞纤维化模型,应用氧化苦参碱干预大鼠系膜细胞纤维化模型,测定模型中IV型胶原蛋白含量及BMP-7、TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3、Smad7表达水平,在细胞水平探讨BMP-7及TGF-β1/Smads信号通路与肾脏纤维化的关系,揭示氧化苦参碱改善糖尿病肾脏间质纤维化的分子机制,为临床用药提供理论依据。目的:研究氧化苦参碱对高糖诱导大鼠肾脏纤维化的影响,探讨氧化苦参碱改善肾脏纤维化的机制。方法:15%胎牛血清的低糖培养基(5.5m M+双抗)培养大鼠肾脏系膜细胞,培养细胞至贴壁生长60%时随机分为两组:正常对照组(NC)和高糖培养基组(HG),正常对照组采用无血清低糖培养基(5.5m M)培养,高糖培养基组则采用无血清高糖培养基(30m M)培养。建立高糖诱导的大鼠系膜细胞纤维化模型,将高糖培养基组随机分为高糖组、氧化苦参碱低(O-L 0.04 mg/ml)、中(O-M 0.08 mg/ml)、高(O-H 0.16 mg/ml)剂量组及坎地沙坦(Con 0.005mg/ml)组,正常对照组仍给予无血清低糖培养基培养,分别干预24小时、48小时、72小时后,观察各组细胞形态学变化;MTT比色法检测各组细胞存活率;用ELISA方法测定培养基上清液中IV型胶原蛋白的含量,确定造模成功。于氧化苦参碱及坎地沙坦干预48小时后,电镜观察药物干预后系膜细胞形态变化;采用Real-Time PCR检测大鼠肾脏系膜细胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的m RNA表达水平;Western-blot检测系膜细胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、p-Smad3及Smad3的蛋白表达水平。结果:1高糖刺激大鼠系膜细胞后,细胞形态及相关指标的变化(1)细胞形态:大鼠系膜细胞经高糖分别干预24小时、48小时、72小时后,与Con组相比,HG组细胞形态改变,三组间形态无明显差异。(2)IV型胶原蛋白含量:HG组培养基上清液中IV型胶原蛋白的含量明显高于正常对照组(P<0.05),提示高糖诱导系膜细胞纤维化造模成功;分别用高糖培养24小时、48小时、72小时后大鼠系膜细胞培养基上清液中IV胶原蛋白的含量有上升趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),提示高糖诱导系膜细胞纤维化可随时间延长有上升趋势,但程度有限。(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信号通路高糖干预48小时后,BMP-7、Smad2、Smad7的m RNA及蛋白表达水平与正常组相比明显降低(P<0.05);TGF-β1、Smad3、CTGF的m RNA及蛋白表达水平明显高于正常组(P<0.05),表明高糖可以促进系膜细胞纤维化的发生。与正常组相比,高糖组Smad2/Smad3比值减小,p-Smad3/Smad3比值显著升高,均具有统计学差异(P<0.05)。2药物干预48小时后,细胞形态、IV型胶原蛋白、BMP-7及TGF-β1/Smads信号通路各项指标的变化(1)细胞形态:药物干预后细胞形态有所恢复,但仍区别于正常对照组。(2)IV型胶原蛋白含量:氧化苦参碱及坎地沙坦各干预组IV型胶原蛋白的含量均明显低于高糖组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05);IV型胶原蛋白的含量随氧化苦参碱剂量增加而逐渐减少,提示氧化苦参碱具有改善肾脏纤维化的作用,其改善作用具有明显的浓度依赖性。坎地沙坦降低IV型胶原蛋白含量的作用优于氧化苦参碱(P<0.05)。(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信号通路基因转录水平与高糖组相比,氧化苦参碱及坎地沙坦各干预组BMP-7、Smad2、Smad7 m RNA水平明显增加(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05);TGF-β1、Smad3、CTGF m RNA的水平明显降低(P<0.05),高于正常对照组(P<0.05);氧化苦参碱各剂量组及坎地沙坦组Smad2/Smad3比值明显高于高糖组(P<0.05)。(4)BMP-7、TGF-β1、CTGF、p-Smad3/Smad3蛋白表达水平与高糖组相比,氧化苦参碱及坎地沙坦各干预组BMP-7蛋白表达水平升高(P<0.05),其中,氧化苦参碱高剂量组BMP-7蛋白表达水平与正常对照组相比不具有统计学差异(P>0.05),氧化苦参碱中、高剂量组仍低于正常对照组(P<0.05)。药物干预组CTGF、TGF-β1的蛋白表达水平低于高糖组(P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05);相比于高糖组,氧化苦参碱及坎地沙坦各干预组p-Smad3/Smad3蛋白表达明显下降(P<0.05),但高于正常对照组(P<0.05)。氧化苦参碱干预后系膜细胞纤维化程度改善。结论:1氧化苦参碱可以改善高糖刺激的大鼠肾脏系膜细胞形态的改变。2氧化苦参碱可以减少IV型胶原蛋白的产生,改善大鼠肾脏纤维化。3氧化苦参碱通过上调BMP-7、Smad2、Smad7的表达,抑制TGF-β1/Smads信号通路,从而逆转大鼠肾脏纤维化,延缓糖尿病肾病的发生。