研究背景乳腺癌是临床上常见的恶性肿瘤,其预防和治疗一直是研究热点。阿片类药物如吗啡、可待因等被临床上广泛用来缓解癌症患者的疼痛。新的研究发现,应用阿片类药物在发挥止痛作用的同时,在神经细胞和肿瘤细胞等多种细胞内都能调节细胞的增殖和凋亡的作用,但这种调节机制尚未明确,存在着争议。基于肿瘤细胞的增殖和凋亡对于调控制肿瘤的发生、发展,以及临床肿瘤治疗过程中阿片类药物的广泛应用,阿片类药物的这种调节作用已成为肿瘤基础研究的热点之一。吗啡是一种μ和δ亚型阿片受体的激动剂,亦是临床广泛应用的镇痛药物,目前已有研究证明吗啡对多种人癌细胞有增殖抑制作用,并且阿片受体在肿瘤细胞中参与和调节肿瘤细胞的增殖与死亡。Arrestins是一类重要的信号调控蛋白和支架蛋白,在G蛋白偶联受体（Gprotein coupled receptors,GPCR）的信号转导和调控中起着重要作用。阿片受体属于GPCR受体超家族的成员之一。在激动剂（如阿片类药物）的作用下GPCR激活G蛋白介导的信号通路并发生磷酸化和内吞,并能作为支架蛋白结合其它信号分子调节细胞内其它信号通路的激活、运输和降解。Arrestins分为四大类:arrestin（又称visual arrestin）,视椎体arrestin及β-arrestins（包括β-arrestin 1和β-arrestin 2）。其中β-arrestins在人体组织中广泛存在,在各种肿瘤组织中也广泛表达。它们具有强大的生物作用,能够负向调节GPCR受体的功能,同时不同程度的调节阿片受体的表达,还具有调节细胞趋化、凋亡和转移的作用,其中β-arrestin 2还具有明显的抑制细胞凋亡的作用。临床上,乳腺癌患者通常要经历一个长期的综合治疗过程,大多数患者会出现免疫抑制和药物耐受等不良反应。这是因为化疗药物不仅能介导肿瘤细胞凋亡,还会作用于免疫细胞对抗肿瘤的免疫应答产生负向调节作用。从而会导致慢性感染、肿瘤生长加速或转移等癌症发展的危险因素发生。最近研究发现表明β-arrestins作为一个多功能的受体分子和骨架蛋白不仅能作用于GPCRs信号传导通路,还能与Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）信号相互作用激活基因,它不仅能负调节脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介导的NF-κB的激活,还能正调节ERK 1/2的激活和特定的促炎症反应基因的表达。TLRs是一个发达保守的受体识别结构家族,能调节自然免疫和抗微生物反应,亦参与对细胞凋亡信号通路的调节。TLRs包括很多种信号途径和受体分子。髓样分化分子（myeloiddifferentiation primary-response protein 88,MyD88）就属于其中一种受体分子,同时也能调节细胞凋亡。它作为一个接头连接TLRs/IL-1Rs（the interleukin-1 receptor）和下游的信号分子,如肿瘤坏死因子受体相关因子6（necrosis factor（TNF）receptor-associated factor-6 TRAF6,TRAF6）、核因子NF-κB（nuclear factor-κB）、促有丝分裂蛋白（mitogen-activated protein,MAP）激酶、TIR相关蛋白（TIR-associated protein,TIRAP）/MyD88相关蛋白（MyD88-adaptor-like protein,Mal）等与免疫转录有关的基因。现在常用于辅佐癌症患者免疫治疗的微生物成分,就是通过TLRs信号来发挥作用的。目前阿片类药物对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及对β-arrestins调节研究较少。β-arrestins与阿片受体结合的功能性结果受到了广泛关注,然而,β-arrestins在阿片介导的细胞凋亡途径中的作用却没有报道。因此本研究拟以人乳腺癌细胞株为研究目标,第一部分观察了阿片类药物吗啡对的肿瘤细胞增殖和凋亡的调控,以及其对肿瘤细胞内β-arrestins表达的调节。发现大剂量的吗啡能介导细胞凋亡。在这一过程中,β-arrestin 1表达改变不明显,而β-arrestin 2的表达明显降低。因此第二部分,我们进一步分析了β-arrestin 2在阿片类药物引起的肿瘤细胞凋亡中的作用,以及其主要信号传导途径。β-arrestin 2还可能是GPCR、TLRs和凋亡途径的一个连接子,作用于TLRs途径中的多个信号分子,激发肿瘤细胞的炎症反应和免疫。因此在论文的第三部分,我们分别干扰了人乳腺癌细胞中β-arrestin 2和MyD88的表达,来检测TLRs信号传导通路中相关的蛋白的变化,探讨人乳腺癌细胞中β-arrestin 2对TLRs信号传导通路的相互作用及其分子机制。第一部分:吗啡对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及G蛋白偶联受体调节蛋白β-arrestins表达影响的研究目的研究和分析阿片类药物吗啡对人乳腺癌细胞株增殖和凋亡的影响,以及吗啡介导的细胞增殖和凋亡中β-arrestins表达的改变。方法不同浓度吗啡作用于人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞不同时间阶段。台盼蓝染色法检测测定吗啡对人乳腺癌细胞增殖活性的作用;利用流式细胞仪检测吗啡对人乳腺癌细胞的细胞周期和凋亡的影响及Caspase家族活性变化;利用RT-PCR技术和Western blot方法分别从分子水平和蛋白水平研究吗啡介导的人乳腺癌细胞增殖和凋亡过程中β-arrestins表达的改变,探讨吗啡对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响以及对β-arrestins表达的影响。结果1.低浓度（≤10μM）吗啡时对人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞增殖有促进作用。高浓度（≥250μM）或大剂量吗啡能够有效抑制体外培养的人乳腺癌细胞株细胞的增殖活性,并呈现时间和剂量依赖关系。2.Nx和吗啡1:1联合作用于细胞,≥250μM时,MCF-7的细胞存活率明显的升高,但在MDA-MB231细胞中作用不明显。3.吗啡可以诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生细胞周期阻滞,细胞主要被阻滞于G1期;并且,这种细胞周期阻滞效应存在剂量依赖性（p＜0.01）。4.吗啡可以诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生凋亡,并且随着作用时间的延长、细胞凋亡率增加（P＜0.01）,而且细胞凋亡率随药物浓度增大而增加。5.在吗啡诱导人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞发生凋亡的过程中Caspase-3和Caspase-8均被激活,二者的活性均随着作用时间延长而增加。6.β-arrestin 1和β-arrestin 2在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231内均高表达。吗啡可以明显降低MCF-7和MDA-MB231细胞内β-arrestin 2 mRNA和蛋白的表达（p＜0.01）,但对β-arrestin 1影响不明显。随着吗啡作用时间延长β-arrestin 2蛋白和mRNA的表达水平均下降,而β-arrestin 1蛋白及其mRNA的表达水平无明显改变。结论吗啡作为一种阿片类药物,不仅可以抑制体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞的增殖活性、引起细胞周期阻滞,还可诱导细胞发生凋亡;Caspase-3和Caspase-8引导的信号通路均参与了吗啡诱导的人乳腺癌细胞凋亡。体外实验乳腺癌MCF-7细胞中,Nx是一种有效的吗啡拮抗剂。吗啡可以通过降低β-arrestin 2的mRNA和蛋白表达,从而在凋亡过程中发挥着重要作用。而β-arrestin 1的mRNA和蛋白表达变化不明显,β-arrestin 1在此过程中可能不发挥作用。第二部分:人乳腺癌细胞中β-arrestin 2对阿片受体介导的细胞凋亡的调节作用及其信号转导机制探讨目的研究和分析β-arrestin 2在阿片类药物引起的肿瘤细胞凋亡中的作用,以及其主要信号传导途径。方法人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞分别转染β-arrestin 2 iRNA和全长β-arrestin 2质粒后,荧光显微镜观察和RT-PCR分析转染率,细胞转染率达85～95%。使用不同浓度吗啡作用于转染细胞不同时间阶段,台盼蓝染色法和MTT细胞存活率分析分别检测β-arrestin 2在吗啡介导的人乳腺癌细胞凋亡和增殖中的作用;细胞转染48小时后,加入2mM吗啡孵育3小时后收集细胞,westernblot分析Akt、Caspase-3、Caspase-8、p53蛋白表达的改变。野生型和β-arrestin2缺失的鼠胚胎成纤维细胞MEF进一步证实结果。结果1.β-arrestin 2干扰后,当吗啡浓度≥500μM时,MCF-7和MDA-MB231细胞增殖率明显降低。2.当吗啡浓度≥250μM时,β-arrestin 2干扰后导致了MCF-7和MDA-MB231细胞死亡率明显升高。3.与只有β-arrestin 2抑制或吗啡处理组相比,β-arrestin 2抑制后吗啡处理组的磷酸化Akt表达明显降低。4.与只有β-arrestin 2干扰后或吗啡处理组相比,β-arrestin 2抑制后吗啡处理组的Caspase-3和Caspase-8激活片段的表达明显升高。5.与只有β-arrestin 2抑制或吗啡处理组相比,β-arrestin 2抑制后吗啡处理组的磷酸化p53的表达明显升高。6.barr^2-/-MEF细胞得到相同结果。结论1.β-arrestin 2在人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231中明显的抑制了吗啡介导的细胞凋亡。2.首次证明了β-arrestin 2通过增强抗凋亡蛋白Akt的表达和抑制促凋亡蛋白P53、Caspase-3和Caspase-8途径来参与吗啡介导的细胞凋亡信号传导通路。第三部分:人乳腺癌细胞中β-arrestin 2对MyD88依赖性Toll样受体信号传导途径的负向调节作用及其机制研究目的研究和分析人乳腺癌细胞中,β-arrestin 2对TLRs信号传导通路的调节作用。方法人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231细胞转染β-arrestin 2 iRNA质粒后,荧光显微镜观察和RT-PCR技术分析转染率,细胞转染率达85～95%。细胞转染不同时间后,使用RT-PCR技术分析TLR2、TLR4、TRAF6、Mal、MyD88基因mRNA表达水平的改变。野生型和β-arrestin 2缺失的鼠胚胎成纤维细胞MEF进一步证实结果。MCF-7和MDA-MB231细胞分别转染DN-MyD88和MyD88-GFP质粒后,荧光显微镜观察和RT-PCR技术分析转染率,细胞转染率达85～95%。细胞转染不同时间后,使用RT-PCR技术分析TLR2、TLR4、β-arrestinl、β-arrestin 2、Mal基因mRNA表达水平的改变。结果1.MCF-7和MDA-MB231细胞中,β-arrestin 2抑制后TLR2,Mal、MyD88基因mRNA表达上调,但TLR4基因mRNA表达无明显改变。2.MyD88抑制后,TLR2、TLR4、β-arrestinl、β-arrestin 2、Mal基因mRNA表达上调,但在MCF-7细胞中TLR4基因mRNA表达改变不明显,在MDA-MB231细胞中Mal基因mRNA表达改变不明显。3.barr2^-/-MEF细胞中,β-arrestin 2抑制后TLR2、TLR4、Mal、MyD88基因mRNA表达上调;MyD88抑制后,TLR2、TLR4、β-arrestinl、β-arrestin 2、Mal基因mRNA表达上调。结论1.TLR2、TLR4、MyD88、Traf6和Mal基因在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231细胞中均表达。2.β-arrestin 2与TLRs信号途径基因TLR2、TLR4、MyD88、Mal（MyD88-adaptor-like）和TRAF6相互作用。3.β-arrestin 2负调节MyD88依赖TLRs信号传导途径基因的表达.4.β-arrestin 2作为一个桥梁连接GPCR和TLRs信号途径。研究意义本课题通过观察阿片类药物吗啡对人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB231增殖和细胞凋亡的影响,首次证明了β-arrestin 2主要通过抑制Akt抗凋亡信号和激活P53、Caspase-3和Caspase-8凋亡信号来参与吗啡介导的细胞凋亡信号传导通路的。这一概念的提出进一步的证实了β-arrestin 2是一个抗凋亡分子,质疑目前少数观点认为的β-arrestin 2促凋亡观点。这为乳腺癌诊断和治疗提供提供新的思路和技术平台。此外,β-arrestins作为一个多功能的受体分子和骨架蛋白不仅能作用于GPCRs信号传导通路,还能TLRs信号相互作用激活基因。对于β-arrestin2与TLRs信号传导途径及该途径中主要信号分子的相互作用的研究,促使我们进一步认识了β-arrestins的非凋亡效应,即促炎症效应,从而为恶性肿瘤的免疫治疗提供新的理论基础,对选定特定的靶分子或符合受体将是一个恶性肿瘤治疗上的突破。