论文部分内容阅读
目的： 探讨疏肝法治疗围绝经期综合征(PMS)大鼠模型的生物学基础，阐明肝郁在围绝经期综合征发病过程中的意义。探讨补肾法治疗围绝经期综合征的生物学基础，揭示自然衰老过程中肾虚对围绝经期综合征发病的意义。从大鼠海马Raf/MEK/ERK通路基因及蛋白的变化，探讨该信号通路在围绝经期综合征肝郁证的分子机制。 方法： 选择13月龄SD大鼠，自然衰老和慢性束缚法建立肝郁证大鼠模型，分为肝郁证模型组、柴胡疏肝散组及丹栀逍遥散组;自然衰老法建立围绝经期综合征大鼠模型，分为围绝经期综合征模型组、左归丸组、右归丸组;3月龄育龄期大鼠为正常对照组，4种中药复方分别干预3周。采用Open-Field-Test进行行为学观察;放射性免疫技术检测外周血E2、FSH、LH;采用ELISA检测外周血、海马神经递质5-HT、NE、beta-ep及外周血GnRH、ACTH、Corticosterone、CRH含量;以实时定量PCR法检测卵巢ER alpha，ER be(i)a，LHR、FSHR mRNA表达。采用HE染色及透射电镜技术，观察正常对照组、肝郁证模型组、柴胡疏肝散组海马的形态结构;以实时定量PCR法检测海马raf1、MEK1/2、ERK1/2的表达;蛋白质印迹技术检测海马raf1、MEK1/2、ERK1/2总蛋白及磷酸化蛋白的表达。 结果： (1)与肝郁证模型组相比，柴胡疏肝散组、丹栀逍遥散组大鼠无论是水平运动得分还是垂直运动得分均出现了显著性提高(p＜0.05)。柴胡疏肝散组、丹栀逍遥散组E2没有显著变化(p＞0.05);柴胡疏肝散组血清FSH出现了显著性降低(p＜0.01);而丹栀逍遥散组血清LH显著性降低(p＜0.01)。柴胡疏肝散组血清GnRH、Corticosterone、CRH均出现了显著性降低(p＜0.05);丹栀逍遥散组只有GnRH显著性下降。与肝郁证模型组相比，柴胡疏肝散组、丹栀逍遥散组血清5-HT、beta-ep含量显著下降，而柴胡疏肝散组NE的含量提高。肝郁证模型组下丘脑5-HT、NE、beta-ep含量显著降低，经给药后，柴胡疏肝散组下丘脑5-HT、NE、beta-ep含量均显著提高，而丹栀逍遥散组只有beta-ep显著提高。与模型组相比，柴胡疏肝散组ER alpha mRNA表达显著性升高(P＜0.01)。柴胡疏肝散组、丹栀逍遥散组ER beta mRNA表达同样降低，但与肝郁证模型组相比，差异无统计学意义。 (2)经过21d给药后，与PMS模型组相比，右归丸组水平运动得分更高(p＜0.05);左归丸组、右归丸组垂直运动得分显著降低(p＜0.05)。与PMS模型组相比，左归丸组、右归丸组大鼠外周血血清E2均出现明显上升，FSH、LH出现显著性下降(p＜0.05)。与正常对照组相比，PMS模型组GnRH、ACTH、Corticosterone、CRH均显著性提高;右归丸组大鼠外周血血清GnRH、ACTH出现显著性下降（p均小于0.05）;左归丸组则没有明显变化;与PMS模型组相比，左归丸组血清5-HT、NE均出现下降;右归丸组血清5-HT、NE、beta-ep含量下降。与正常对照组相比，PMS模型组大鼠下丘脑5-HT、NE、beta-ep含量显著降低。经给药后，左归丸组NE、beta-ep含量均显著提高，而右归丸组则没有明显变化。与PMS模型组相比，左归丸组ER alpha mRNA表达升高（P＜0.01）;左归丸组、右归丸组ER beta mRNA表达都降低（P＜0.01）。 (3)海马的超微结构显示:肝郁证模型组神经元细胞线粒体数目较少，核膜结构不完整;柴胡疏肝散组神经元细胞核排列整齐，核膜较完整，线粒体数目较少。定量PCR结果显示，肝郁证模型组Mek2及Erk2 mRNA表达降低，经过柴胡疏肝散灌胃给药21d后，柴胡疏肝散组Mek2及Erk2 mRNA表达提高。蛋白质印迹技术结果表明，raf1，MEK1/2，ERK1/2总蛋白在3组大鼠海马中没有显著性差异(p＞0.05);p-raf1，p-MEK1/2，p-ERK1/2三种磷酸化蛋白在肝郁模型组中表达均下调，而经过21d柴胡疏肝散灌胃给药后，这些蛋白表达水平都显著性提高(p＜0.05)。 结论： (1)自然衰老的围绝经期综合征大鼠模型具有肾虚的病理特点。补肾法对围绝经期综合征大鼠模型的激素、激素受体及神经内分泌网络起到一定的调节作用。 (2)疏肝法主要通过下丘脑-垂体-肾上腺轴调节神经内分泌系统来治疗围绝经期综合征;补肾法主要通过提高外周血雌激素水平，进而影响单胺类神经递质达到治疗围绝经期综合征的目的。 (3)围绝经期综合征肝郁证大鼠海马Raf/MEK/ERK信号通路受到抑制，而柴胡疏肝散治疗可激活这个信号通路，表明Raf/MEK/ERK信号通路失衡可能是围绝经期综合征肝郁证的重要分子机制之一。