研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是主要发病于儿童和青少年且发病率最高的原发性恶性骨肿瘤。目前应用手术、化疗以及放疗等传统治疗仍有很多病例会出现远处转移,以肺转移最常见,转移患者存活率仍然较低,骨肉瘤的转移与复发是影响患者存活率的主要影响因素。因此有必要深入探究骨肉瘤发生侵袭和转移的机制,通过发现新的治疗手段抑制肿瘤的侵袭和转移以提高骨肉瘤患者的存活率。但骨肉瘤转移是涉及肿瘤细胞迁移和侵袭为主的多因素、多阶段的复杂环节,受到多个促肿瘤转移癌基因的调控,目前其转移相关的分子机制仍未阐明。miRNA是一类主要存在真核生物中长约18-25个碱基的的非编码的RNA分子,通过与靶基因的3’UTR碱基互补配对直接抑制mRNA的转录或蛋白质翻译,在基因转录后的调控中发挥着重要的作用。目前研究发现miRNA与肿瘤的发生发展密切相关,通过调控不同的靶基因促进或抑制肿瘤发生、增殖、转移、分化、凋亡以及血管生成的过程。越来越多的研究表明,一些miRNA在骨肉瘤患者中表达异常,调控着骨肉瘤细胞的发生、增殖、转移、凋亡等生物学行为。基因芯片筛查发现miR-664在骨肉瘤中过表达并与骨肉瘤患者的存活率相关,但在骨肉瘤的转移和侵袭中miR-664是否发挥着某种作用以及相应的靶基目前尚不清楚。研究目的：一、选取不同株的人骨肉瘤细胞株以及骨肉瘤组织标本,探究：1、骨肉瘤细胞株相对于正常人成骨细胞株miR-664的表达水平；2、骨肉瘤组织相对于癌旁组织miR-664的表达水平。二、构建miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control质粒,转染进入MG-63骨肉瘤细胞株,建立稳定过表达或低表达miR-664的细胞株,利用Transwell趋化、侵袭实验和细胞划痕实验探究：1、转染miR-664 mimic质粒相对于miR-664 negative control质粒转染的MG-63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力；2、转染miR-664 inhibitor质粒相对于miR-664 negative control质粒转染的MG-63骨肉瘤细胞株中骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。三、利用生物信息学方法预测：1、miR-664作用的靶基因；2、检测所筛选的miR-664靶基因的生物学功能及可能的作用信号通道。研究方法：1、骨肉瘤细胞培养人骨肉瘤细胞株SOSP-9607、U2-OS、SAOS-2、HOS、MG-63采用含100U/ml青霉素和1 00U/ml链霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养,人成骨细胞株hFOB1.19采用DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验,2-3天换液一次,根据细胞的密度传代。2、骨肉瘤组织标本收集8例骨肉瘤癌组织和对应癌旁组织(adjacent noncancerous tissues, TAT)均来源于湖南省郴州市第一人民医院及广东省韶关市粤北人民医院标本库,所有标本均为活体组织取下后即放于液氮中保存直至使用。所有患者均经病理学检查确诊为骨肉瘤,尚未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3、RNA抽提与荧光定量PCR分别利用mirVana miRNA抽提试剂盒从培养的细胞和新鲜切除的骨肉瘤组织中抽提RNA,利用Taqman miRNA逆转录试剂盒合成cDNA, miR-664的表达水平通过miRNA特异性的TaqMan MicroRNA试剂盒,使用ABI公司的7500 Real-time PCR仪进行荧光定量PCR反应,检测各模板的Ct值(C为cycle,T为threshold),每个样品重复3次,阴性对照采用DNase/RNase-free water为模板,通过相对定量以Folds=2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度,公式如下：-ΔΔCt=2-lCt(miR-664)-Ct(U6)]4、Western blot提取细胞内总蛋白,采用考马斯亮蓝法对蛋白进行浓度测定。采用SDS-PAGE对蛋白电泳、转膜后,用5%脱脂牛奶封闭,加入SOX7一抗、相应的二抗,显影和定影。使用a-tubulin作为内参。5、细胞的转染转染前24h,将MG-63细胞用0.25%胰酶消化离心计数后,将细胞密度调整至5×105/ml,将各组(miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 negative control)5μg重组质粒与lipofectamine 2000混合,轻轻混匀后室温孵育20min,加入到已经接种细胞的6孔板内,37℃、5%CO2饱和湿度下的培养箱中孵育6h,将培养基更换为含10%胎牛血清的完全培养基中培养。培养48h后抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR检测瞬时转染后各组miR-664的表达,6、细胞划痕实验划痕实验前48h,将细胞密度调整至5×105/ml,接种单细胞悬液于六孔板中培养24h,使细胞的密度达到约90-95%后将细胞培养上清吸出,再更换无血清的培养基继续培养细胞24h,使用20μl无菌的加样枪头在每孔中长满细胞的单细胞层中轻轻并迅速地划1-2道痕,用新鲜的无菌PBS冲洗板1次除去上清中漂浮的细胞并更换新鲜的完全培养基。分别在0h与24h时间点在显微镜下拍照。测量划痕两侧细胞之间的距离,每组设平行3个孔,计算0h的最大划痕与24h测划痕距离,计算不同组细胞划痕修复的速度,计算三个孔的平均值。7、ELISA试剂盒说明书的说明,将标准品用蒸馏水稀释到指定的浓度,将待检测的上清样品用sample diluent稀释。计算好总的样本数(包括标准品孔、空白孔、以及样品孔,其中样品孔每个样品做相应的复孔),取出已经包被好MMP9的96孔板,分别每孔加入100μl标准品或样品,空白孔加入相应量的样品稀释液,而后加入50μl稀释好的一抗,37℃孵育2h,用washing buffer洗5次,每次1-2min；分别每孔加入100μl稀释好的二抗,室温孵育30min后用washing buffer洗三次,每次3min。加入底物TMB,每孔100μl,显色15min后,每孔加入100μl终止液；450nm吸收波长测吸光值,计算细胞因子的相对浓度。8、骨肉瘤3D培养模型将细胞浓度调整至2×105/ml。将Matrigel胶完全覆盖24孔板底时,将24孔培养板置于37℃培养箱中约1h,待Matrigel胶重新凝固；将细胞悬液加入其中,置于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养10天,10天内每隔2天在倒置显微镜下观察细胞的形态,并拍摄相应的照片。9、Transwell小室趋化和侵袭实验接种1.0×104个细胞于Transwell小室中,将50μl稀释好的Matrigel基质胶均匀铺于Transwell小室底部,37℃培养箱中放置3h。将各组MG-63骨肉瘤细胞接种前12h用无血清DMEM培养以去除血清对实验结果的影响。小室内加入200μl的无血清的DMEM培养基,于transwell小室下腔加入500gl含10%FBS的DMEM培养基,继续培养24h。然后从24孔板中取出Transwell、室,1×PBS轻轻冲洗3次,用棉签擦尽小室内的细胞,然后将小室置于1%多聚甲醛中固定10min,取出小室放入苏木精中浸泡,染色5min。沿小室底部边缘剪下滤膜,显微镜下观察穿透滤膜或Matrigel胶的细胞,于200倍光学显微镜下计数5个视野的细胞,取平均值,重复计数3次。10、生物信息学预测利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因预测的生物信息学网站中对miR-664的靶基因进行分析预测,分析显示SOX7可能是miR-664潜在作用的靶基因。11、荧光素报告酶系统检测由广州复能基因有限公司合成重组质粒pGL3-SOX73’UTR,将miR-664mimic、inhibitor、negative control、mut与pGL3-SOX73’UTR共同转染进入MG-63骨肉瘤细胞。转染48h后吸去上清中的培养基,用PBS清洗2次,每孔加入100μl Passive Lysis Buffer,室温轻轻振荡,裂解15min,先用GloMax生物发光检测仪读取细胞裂解后的背景值,每孔加入100μl luciferase底物,涡旋振荡混匀,读取相应的值,每孔加入100μlStop Reagent,振荡混匀后,测定各组荧光值。12、siNRA转染为进一步明确miR-664是否通过SOX7进行调控骨肉瘤MG-63细胞侵袭迁移能力,我们利用SOX7 siRNA干扰SOX7的表达并进一步利用Transwell趋化、侵袭实验观察低表达SOX7对MG-63骨肉瘤侵袭迁移能力的影响。SOX7siRNA#1及SOX7 siRNA#2由广州锐博生物科技有限公司合成并纯化,序列如下：SOX7 siRNA#1:TCTTGCTACAAAGCCTAAGTG SOX7 siRNA#2:TTGTCCATCCGACAGCTCGGC选MG-63 inhibitor组进行转染,方法如步骤5所述,分为MG-63 miR-664 inhibitor+NC、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#1、MG-63-miR-664 inhibitor+SOX7 siRNA#2三组。13、Western blot检测SOX7 siRNA干扰后SOX7表达转染48小时后收集各组细胞并应用Western blot检测SOX7蛋白水平,方法如步骤4所述。14、siRNA干扰后transwell趋化、侵袭实验取NC组、SOX7 siRNA#1组及SOX7 siRNA#2组MG-63骨肉瘤细胞进行Transwell趋化、侵袭实验,方法如步骤9所述。15、统计学方法各骨肉瘤细胞株与人成骨细胞株hFOB1.19 miR-664的表达,mimic组与NC组、inhibitor组与NC组SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表达,NC组与mimic组、NC组与inhibitor组,NC组与mut组荧光酶活性涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义；mimic组与NC组、inhibitor组与NC组、mut组与NC组的MMP9表达涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义；siRNA#1组与NC组、siRNA#2组与NC组的SOX7蛋白表达、Transwell趋化实验、Transwell侵袭实验中涉及的两组数据之间的比较采用两独立样本的t检验,P<0.05为差异有统计学意义。利用双变量分析组织中miR-664与SOX7表达的相关性。研究结果：1、miR-664在骨肉瘤细胞株和骨肉瘤组织中的表达水平显著上调相较于对照组人成骨细胞株hFOB1.19细胞株,miR-664在5种骨肉瘤细胞株中(HOS、SAOS-2、SOSP-9607、MG-63和U2-OS)均显著表达上调(P<0.05),8例骨肉瘤组织标本中的miR-664表达显著高于对应的癌旁组织(P<0.05)。2、miR-664过表达可提高MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力转染miR-664 mimic后MG-63骨肉瘤细胞miR-664的表达增高了17.998倍(P<0.05)。Transwell小室迁移和侵袭实验显示无论上下层培养液以聚碳酸酯膜或Matrigel胶相隔,mimic组穿透滤膜或Matrigel胶的染色细胞均较NC组显著增加(P<0.05)。利用Matrigel胶建立骨肉瘤细胞3D培养的结果显示mimic组MG-63骨肉瘤细胞在10天的培养过程中逐渐生成无极性球状细胞克隆,随着培养时间的延长细胞克隆表面开始伸出丝状伪足,而NC组的细胞3D培养下的形态生成较小的球状克隆及形成较少的丝状伪足。细胞划痕实验结果显示mimic组的MG-63骨肉瘤细胞划痕修复速度显著快于NC组(P<0.05)。3、下调miR-664可以降低MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力转染miR-664 inhibitor后MG-63骨肉瘤细胞miR-664的表达降低了78.7%(P<0.05)。Transwell小室迁移和侵袭的实验显示无论上下层培养液以聚碳酸酯膜或Matrigel胶相隔,inhibitor组穿透滤膜或Matrigel胶的染色细胞较NC组显著减少(P<0.05)。利用Matrigel胶建立骨肉瘤细胞3D培养的结果显示inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞在10天的培养过程中生成无极性球状细胞克隆较NC组小且无明显丝状伪足。细胞划痕的实验结果显示inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞划痕修复速度显著慢于NC组(P<0.05)。4、SOX7基因是miR-664直接作用的靶基因我们利用TargetScan (http://www.targetscan.org) miRNA靶基因预测的生物信息学网站对miR-664的靶基因进行分析预测,根据miRNA与靶基因3’UTR不完全配对的原则分析显示SOX7可能是miR-664潜在作用的靶基因。分别检测mimic组、inhibitor组及NC组MG-63骨肉瘤细胞中SOX7、β-catenin及MMP7蛋白的表达水平。Western blot结果显示,与NC组相比mimic组中的SOX7蛋白表达显著下降(P<0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表达显著上升(P<0.05)；inhibitor组SOX7蛋白表达量显著上升(P<0.05),而β-catenin、MMP7蛋白表达显著下降(P<0.05)。为进一步验证SOX7的3’UTR是否具有miR-664结合的位点,构建SOX7蛋白的3’UTR部分序列表达载体pGL3-SOX73’UTR,将其分别与miR-664 mimic、inhibitor negative control及mut共同转染到MG-63骨肉瘤细胞中,利用pGL3荧光素酶报告系统监测miR-664是否与SOX7蛋白相结合。与NC组相比,将pGL3-SOX73’UTR与miR-664 mimic共转染可显著降低荧光素酶的活性(P<0.05),将pGL3-SOX73’UTR与miR-664 inhibitor共转染可显著增强荧光素酶的活性(P<0.05),而将pGL3-SOX73’UTR与miR-664 mut或miR-664 negative control共转染均不能改变荧光素酶的活性(P>0.05),提示miR-664与SOX7’3UTR可特异性结合,即SOX7是miR-664的靶基因。ELISA结果显示与NC组相比mimic组中的MMP9表达显著上升(P<0.05),而inhibitor组MMP9表达显著下降(P<0.05)。5、抑制SOX7表达促进MG-63骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭为了进一步验证SOX7在骨肉瘤体外的迁移和侵袭中的功能,我们在inhibitor组MG-63骨肉瘤细胞株中利用siRNA干扰SOX7的表达,Transwell小室趋化、侵袭实验结果显示,相对于NC组,siRNA干扰后骨肉瘤细胞MG-63的迁移和侵袭能力显著增强(P<0.05),两种siRNA均对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭具有显著的促进作用。6、miR-664与SOX7基因表达在骨肉瘤病人组织中的相关性分析荧光定量PCR的结果显示,6例骨肉瘤病人组织中miR-664相对于癌旁组织的表达显著上调。相对于癌旁组织中,SOX7在骨肉瘤病人组织中的含量显著下调。接下来我们对6例骨肉瘤组织和2例癌旁组织中miR-664表达水平与SOX7作相关性分析,统计学的结果显示miR-664的表达水平与SOX7呈负相关的线性关系(r=-0.91,P<0.05)。结论：1、miR-664在骨肉瘤细胞株和组织中表达水平显著上调；2、过表达miR-664显著促进骨肉瘤细胞株的迁移和侵袭；3、SOX7是miR-664作用的一个靶基因,抑制SOX7可显著促进骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭；4、miR-664和SOX7在骨肉瘤病人组织中的表达水平呈负相关性；5、SOX7可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力。