背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是危害人类健康的常见疾病,主要病理表现为动脉内膜的脂质沉积、炎细胞浸润、平滑肌细胞和基质增生、内膜增厚、管腔狭窄和血栓形成等。它是一个多因素参与、多基因异常调控的复杂病理过程。普遍认为胆固醇和胆固醇酯在巨噬细胞中的聚集和泡沫化对动脉粥样硬化的形成起重要作用,因此,影响胆固醇摄取、合成及流出和维持胆固醇细胞内平衡的因素是动脉粥样硬化机制研究的关键。由ABCA1及其上游调控因子如细胞核受体家族里的肝X受体(LXR)、过氧化物酶体增殖物激活型受体(PPAR)、糖皮质激素受体(GR)以及环磷酸腺苷(cAMP)、细胞因子(TNF-α,IL-1β)和一些蛋白激酶等组成的信号通路在胆固醇逆向转运和胆固醇代谢过程中发挥着关键调节作用。多项研究表明,增强ABCA1表达可促进细胞内胆固醇流出从而发挥抗动脉粥样硬化作用。ABCA1可作为防治As和心血管疾病的一个有效的干预靶点。目前临床上应用较广泛的抗As和调节胆固醇逆向转运的药物主要有贝特类药物、他汀类药物、普罗布考和CETP抑制剂等,以上药物在防治心血管疾病方面都具有一定的疗效。特别是他汀类药物,不仅能特异性抑制细胞内HMG-CoA还原酶而使内源性胆固醇合成减少,还可以通过增强LXRα和ABCA1的表达来促进胆固醇外流,同时促进肝细胞ApoAI的合成从而升高HDL。但长期大量使用以上药物易引起肌炎和肝功能受损等不良反应。因此,探寻新的抗As策略如挖掘中华民族瑰宝中药在防治As方面的作用及机制意义重大。既往关于中药的方剂研究由于药物成分复杂,作用机制难以阐明,所以尽管疗效显著,但也难以被国际学术认可。因此,近年来,很多学者将研究的目光转向成份单一,化学结构明确的中药单体,并取得丰硕的研究成果。有研究表明,姜黄素、小檗碱、黄岑苷等多种中药单体可通过降血脂、抑制炎症、减轻氧化应激作用、抑制血管平滑肌细胞增殖以及改善微循环等途径发挥抗As的作用。本研究经过前期临床病例观察和调研,对临床上疗效显著的中药及方剂中君药的中药单体成份进行归纳汇总,从中筛选出7种作用机制未明,报道较少的单体进行研究。在第一部分研究内容中,我们首先采用qPCR、油红O染色、网络药理学计算机模拟分子对接和表达谱基因芯片等方法筛选出有效的中药单体灯盏花乙素(又称野黄芩苷,scutellarin)及其可能的作用靶点和信号通路。然后,在论文的第二部分,通过qPCR、Western Blot、油红O染色、荧光法测细胞内胆固醇流出率等方法,探讨灯盏花乙素的最佳作用浓度和时间;并利用siRNA进行信号通路的干预,阐明灯盏花乙素通过PPARα/γ-LXRα-ABCA1途径促进胆固醇逆向转运从而发挥抗As的作用机制。最后在第三部分中,以ApoE-/-小鼠建立动物模型,观察灯盏花乙素在体内对小鼠体重、肝脏内脂质蓄积和主动脉及主动脉窦斑块面积的影响,并检测小鼠腹腔巨噬细胞中PPARα/γ-LXRα-ABCA1通路相关基因的表达情况,明确灯盏花乙素在体内的抗AS作用及具体机制。本研究为中药单体发挥抗As作用的靶点筛选搭建了方法平台;揭示了灯盏花乙素通过PPARα/γ-LXRα-ABCA1途径促进胆固醇逆向转运从而发挥抗As的作用机制;也为中药单体抗As的机制研究提供新的思路和方法。第一部分 抗动脉粥样硬化中药单体及其靶点的筛选目的:从7种中药单体中筛选具抗动脉粥样硬化作用的中药单体及其作用靶点和可能的信号通路。方法:首先建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型,用7种不同中药单体处理泡沫细胞后,通过qPCR检测细胞内炎症因子(TNF-α,IL-1β以及转录因子NF-κB)、胆固醇流出调节蛋白(ABCA1、ABCG1、SRB1)、胆固醇合成调节蛋白(HMGCR、HMGCS)、胆固醇吸收相关蛋白(SRA1、CD36)以及胆固醇运输相关蛋白(CAV-1、NPC1)的mRNA水平;初步筛选出有效的中药单体后,通过油红O染色方法观察目的中药单体(灯盏花乙素)对泡沫细胞内脂质蓄积的影响;并通过网络药理学的计算机模拟分子对接方法筛选7种中药单体与上述qPCR所测基因及可能的通路调节蛋白的亲和力,预测作用靶点和通路调节蛋白;最后再利用基因芯片分析表达谱,预测目的中药单体(灯盏花乙素)的作用靶点及通路。结果:qPCR结果显示7种中药单体中,灯盏花乙素可以抑制泡沫细胞炎症因子TNF-α,胆固醇合成蛋白HMGCR、HGMCS,胆固醇吸收相关蛋白SRA1、CD36的表达,同时上调胆固醇流出蛋白ABCA1、ABCG1的表达。通过油红O染色观察,发现灯盏花乙素可以使泡沫细胞胞内脂质蓄积明显减少,其中10μM浓度作用效果最明显。用分子对接方法模拟计算筛选出灯盏花乙素的高亲和力靶点为NPC1、PPARα、ABCA1、HMGCS,提示灯盏花乙素可能通过HMGCS抑制胆固醇合成并通过PPARα、ABCA1调节促进细胞内胆固醇流出。基因芯片结果显示,灯盏花乙素作用泡沫细胞后,310个基因表达具有显著差异,包括PPARα和ABCA1表达上调,从而推测灯盏花乙素通过直接上调ABCA1或者通过激活PPARα进而促进ABCA1表达,发挥胆固醇逆向转运作用。结论:中药单体灯盏花乙素可以使THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质蓄积明显减少,具有抗动脉粥样硬化的作用;PPARα、ABCA1可能是灯盏花乙素发挥抗As作用的主要靶点;灯盏花乙素也可能通过下调TNF-α发挥抗炎作用。第二部分 灯盏花乙素通过PPARα/γ-LXRα-ABCA1通路促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出目的:探讨灯盏花乙素通过PPARα/γ-LXRα-ABCA1途径促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的分子机制。方法:建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型后,用不同浓度(5μM、10μM、20μM)的灯盏花乙素处理泡沫细胞不同时间(0h、12h、24h、48h),然后采用qPCR与Western blot方法检测泡沫细胞ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα等各通路相关基因的mRNA以及蛋白水平;使用油红O染色和荧光胆固醇流出试剂盒检测泡沫细胞内胆固醇流出率。接下来,用siRNA分别沉默LXRα、PPARγ或者PPARα后,采用qPCR与Western blot方法检测基因沉默后灯盏花乙素对泡沫细胞ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα的mRNA以及蛋白表达的影响;用油红O染色和荧光胆固醇流出试剂盒检测基因沉默后灯盏花乙素作用下的泡沫细胞内胆固醇流出率。结果:与对照组即泡沫细胞模型组相比,5μM灯盏花乙素处理组中,ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARα四个基因的mRNA和蛋白表达都未见明显升高,油红O染色观察和荧光胆固醇流出率检测也未见明显的胆固醇流出;10μM和20μM灯盏花乙素处理组中ABCA1、LXRα、PPARα和PPARγ的mRNA和蛋白表达均显著上调,且ABCA1具有浓度依赖性。同时,油红O染色和荧光胆固醇流出率检测结果均显示,泡沫细胞经过10μM和20μM浓度灯盏花乙素作用后细胞内脂质蓄积明显减少,胆固醇流出率明显增多,但流出率在10μM和20μM两组间无统计学意义。在时间梯度实验中所示,灯盏花乙素(10μM)作用泡沫细胞24hour和48hour后,ABCA1、LXRα、PPARα和PPARγ的mRNA和蛋白表达均显著上调,仅ABCA1在转录水平和蛋白水平都呈现了时间依赖性。综上,摸索出在THP-1单核巨噬细胞源性泡沫细胞模型中,灯盏花乙素抗As的最佳作用条件为10μM,作用24hour。进一步利用siRNA沉默LXRα、PPARγ和PPARα的表达后,使用灯盏花乙素最佳作用条件处理基因沉默后的泡沫细胞,qPCR和Western Blot结果显示ABCA1的mRNA和蛋白表达明显下调;油红O染色和荧光法测胆固醇流出率结果显示泡沫细胞内胆固醇流出降低,细胞内脂质蓄积未见明显减少。分别单独沉默PPARα和PPARγ,灯盏花乙素作用结果显示LXRα和ABCA1的mRNA和蛋白表达都出现显著下调;单独沉默LXRα,灯盏花乙素作用结果结果显示ABCA1的mRNA和蛋白表达都出现显著下调;结论:灯盏花乙素促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的最佳作用浓度是10μM;灯盏花乙素上调THP-1单核巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1、LXRα、PPARγ和PPARαmRNA和蛋白的表达;沉默LXRα、PPARγ和PPARα会抑制Scutellarin诱导的THP-1单核巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出。灯盏花乙素通过PPARα-LXRα-ABCA1和PPARγ-LXRα-ABCA1两条通路途径调控ABCA1表达,从而促进胆固醇逆向转运。第三部分 灯盏花乙素对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响目的:建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变模型,观察灯盏花乙素在体内的抗As效果。方法:选取8周龄的ApoE基因敲除雄鼠,高脂饮食喂养8周后建立ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠,然后随机分为As模型组(腹腔注射与药物组同等剂量的生理盐水)和Scu药物组(腹腔注射灯盏花乙素10mg/kg/day)两组。给药8周后检测两组小鼠体重变化;用油红O染色观察肝脏组织冰冻切片、主动脉窦冰冻切片和主动脉树脂质沉积情况;用图像分析软件Image-pro plus 6.0计算主动脉树和主动脉窦的斑块面积大小与比例。用qPCR和western blot方法检测小鼠腹腔巨噬细胞的PPARγ、PPARα、LXRα、ABCA1 mRNA水平和蛋白水平。用qPCR方法检测主动脉组织、肝脏组织的PPARγ、PPARα、LXRα、ABCA1 mRNA水平;结果:两组小鼠之间的体重并无明显差异。对小鼠主动脉树和主动脉窦冰冻切片进行油红O染色,并通过图像分析软件扫描计算主动脉树动脉粥样硬化病变面积和主动脉窦斑块总面积和红色脂滴面积,结果发现,与As模型组相比,Scu药物组的主动脉树上动脉粥样硬化病变面积明显减少;主动脉窦切片中红色脂滴面积明显减少。小鼠肝脏冰冻切片的油红O染色结果显示Scu药物组的小鼠肝脏中脂质沉积明显减少。肝脏组织的qPCR结果显示,Scu药物组的PPARα、LXRα和ABCA1的mRNA表达显著上调,而PPARγ在两个组间表达无显著差异。在小鼠腹腔巨噬细胞中,Scu药物组的PPARα、LXRα和ABCA1的mRNA和蛋白水平都出现了表达显著上调,而PPARγ在两个组间表达无统计学意义。在小鼠主动脉组织中,与As模型组比较,Scu药物组的PPARα和ABCA1的mRNA同样显著性上调表达,而PPARγ、LXRα两者mRNA的表达差异不明显;结论:灯盏花乙素注射液可减少ApoE-/-小鼠肝脏中脂质沉积。灯盏花乙素注射液可减少ApoE-/-小鼠主动脉内膜上粥样斑块病变面积和脂质沉积。灯盏花乙素注射液能升高ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞中ABCA1、LXRα、PPARα三者的mRNA和蛋白的表达;能升高ApoE-/-小鼠肝脏中ABCA1、LXRα、PPARα三者的mRNA水平;能上调主动脉血管中ABCA1和PPARα的mRNA表达。灯盏花乙素在APOE-/-小鼠体内可能是通过PPARα-LXRα-ABCA1通路促进胆固醇逆向转运从而发挥抗动脉粥样硬化作用。