禽腺病毒（fowladenovirus,FAdV）是一种无囊膜的双链DNA病毒。当宿主受到感染压力或者免疫力下降,腺病毒就可能引发疾病或死亡,目前,禽腺病毒血清4型占主导地位,多呈急性感染,病程短、死亡率高,给养殖业带来巨大损失。目前针对禽腺病毒引起的各种疾病尚无有效的治疗和免疫措施,预防仅仅依靠加强饲养和生物安全管理。先天性免疫是机体免疫防御的重要组成部分,能迅速对各种病原入侵产生相应的免疫应答,消灭病原和激活后续获得性免疫等功能。本研究首先对FAdV感染DF-1细胞后先天性免疫信号通路中信号传递的关键因子进行检测,分析转录水平明显差异变化的基因作为研究对象;构建sgRNA后应用CRISPR/Cas9基因编辑系统,对DF-1细胞的先天免疫信号通路中相关基因进行敲除;对改造前后DF-1细胞对FAdV感染的应答机制和病毒在该细胞中增殖效率进行研究。1.本研究使用qRT-PCR分析DF-1细胞应对FAdV感染的先天性免疫有关的基因转录水平,在24 h的感染期内分5个时段对84个表达基因进行测定,其中,先天免疫反应和炎症反应相关的主要基因在FAdV感染DF-1细胞后显著上调。2.筛选出IFNB、TLR7、IL6、IL8、FASLG、STAT4共6个基因,构建Cas9表达载体和sgRNA载体,共转染DF-1细胞,依照GFP 阳性特征分选、培养上述基因敲除的单细胞克隆,PCR验证后,获得5个基因敲除的细胞库（DF-1-IL8-KO、DF-1-IFNB-KO、DF-1-TLR7-KO、DF-1-FASLG-KO 和 DF-1-STAT4-KO）与 4 个基因敲除的单克隆细胞系（DF-1-TLR7-KO#1、DF-1-TLR7-KO#2、DF-1-TLR7-KO#3 和 DF-1-IL6-KO）。对上述细胞接种病毒后检测病毒效价,同时,构建FAdV荧光定量检测方法,直接检测样本中病毒拷贝数。最终筛选出DF-1-TLR7-KO#3号单克隆细胞系,并命名为DF-1-TLR7-KO细胞。该细胞株表现出最好的病毒增殖效果,DF-1母细胞增殖FA dV效价稳定在7.71gTCID50/mL,DF-1-TLR7-KO细胞增殖FAdV的病毒效价维持在8.5～8.93 lgTCID50/mL。敲除TLR7编码序列的DF-1单克隆细胞系,经CCK-8法比对增殖曲线分析,表明该细胞系与DF-1母细胞增殖能力无明显差异。3.以qPT-PCR检测FAdV感染DF-1-TLR7-KO细胞后先天性免疫相关基因的转录水平,同样在24 h的感染期内分5个时段对84个表达基因进行测定,TLR7编码基因缺失株先天性免疫相关基因的表达量增长倍数较母细胞少,表明敲除细胞系对FAdV感染的先天性免疫应答减弱。使用TLR7激动剂咪喹莫特（Imiquimod）药物作用母细胞和敲除细胞系,构建类似回补表达体系。在DF-1细胞中,Imiquimod处理对FAdV在细胞中的增殖有较为明显的抑制作用,说明Imiquimod有利于细胞的抗病毒作用。在TLR7敲除细胞株中,Imiquimod的处理对FAdV在细胞中的增殖没有明显影响,且病毒拷贝数远远高于DF-1母细胞,说明TLR7基因的敲除有利于病毒增殖。传统的鸡胚虽易于进行病毒增殖,但需要消耗大量的SPF鸡胚,生产周期长,产量不稳定,难以进行病毒大规模生产,无法在短期内提供足够的疫苗产品。本研究使改造后的细胞株稳定扩增病毒,在一定程度上提高病毒滴度,为疫苗生产提供良好的原材料。此外,本研究还对禽源细胞的天然免疫信号通路与FAdV感染的互作机制进行了初步探索,对特定Toll样受体基因敲除提高病毒在细胞中的增殖能力进行了成功的尝试,为更好地研究宿主对病毒入侵的应答机制,构建和筛选优质禽源细胞进而提高疫苗生产效能奠定了坚实基础。