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背景:哺乳动物精子在睾丸中发生发育并在附睾中成熟后,并不完全具有授精能力。当精子进入雌(女)性生殖道后,理化环境的改变激发精子的获能、超活化、趋化性和顶体反应等重要生理功能,使得精子与卵细胞成功受精。研究表明,卵泡液、卵丘细胞分泌液和透明带都能够诱导和激活精子上述重要生理功能。孕酮是卵泡液和卵丘细胞分泌液中的有效成份之一,能够在短时间内引起钙离子内流和氯离子外流,同时增加细胞内环化腺核苷酸含量,调节精子的获能、顶体反应、超活化和趋化性等重要生理功能。因以上孕酮介导的效应不通过调控基因表达实现,故被称为人精子孕酮非基因组效应。近年来,主流观点认为孕酮是通过激活人精子特异性钙通道CatSper引起钙信号的变化来实现对精子相关生理功能的调控,但目前关于孕酮是否直接作用于CatSper仍存在较多争议。最近Miller等人的研究发现孕酮在活化人精子质膜上的水解酶ABHD2后,ABHD2继而可以水解人精子膜上抑制CatSper通道开放的大麻素2-AG,并最终导致CatSper通道激活,这提示孕酮并不是通过直接结合CatSper通道激活其钙电流。然而,尚缺少更为直接的证据证实ABHD2是人精子孕酮受体。孕酮-脂联素受体(progestin–adiponectin Q receptor,PAQR)属于一类新命名的膜蛋白受体家族,其成员具有G蛋白偶联受体类似的7次跨膜结构域。目前该家族在人类中有11个成员,包括孕酮受体和脂联素受体两个亚群。其中,人孕酮-脂联素受体7(hPAQR7,亦被称作mPRα)属于PAQR家族中的孕酮受体亚群,主要在卵巢和睾丸等生殖相关组织中表达。同位素标记的孕酮结合实验结果表明hPAQR7与孕酮的结合具有高亲和性﹑饱和性﹑特异性和可逆性等特征,符合孕酮受体的特点。最为重要的是,在人成熟精子细胞膜上中能检测到hPAQR7蛋白,主要定位在精子尾部,且其功能可能与人成熟精子运动有关。然而,作为人精子中孕酮膜受体的理想候选蛋白,hPAQR7在人成熟精子响应孕酮过程中所起作用及其机制尚不清楚。实验目的:本文旨在揭示hPAQR7介导人成熟精子响应孕酮的作用和机制,补充和完善现有孕酮对人精子CatSper激活机制,并为男性不育诊疗提供新的分子靶标。实验方法:1)免疫组化检测hPAQR7在成年人和老年人睾丸中的表达和分布情况;2)反转录PCR和免疫印迹检测人成熟精子中是否存在hPAQR7的转录本和蛋白质;3)亲和素亲和层析和超高分辨显微技术验证孕酮与人精子中hPAQR7的结合并进一步检测孕酮-hPAQR7在人精子中的结合部位;4)精子穿透甲基纤维素实验评价人精子超活化运动能力;5)金霉素染色(CTC)评价人精子发生顶体反应的概率;6)单细胞钙成像系统检测人精子胞内钙浓度变化情况;7)Western blotting定量分析人精子中hPAQR7含量;8)超分辨显微技术检测孕酮与hPAQR7在人精子中的结合部位;9)免疫荧光验证hPAQR7、CatSper、ABHD2在人精子中的共定位;10)精子膜片钳技术记录hPAQR7抗体对孕酮激活人精子CatSper通道电流的影响;11)免疫共沉淀技术验证hPAQR7、CatSper、ABHD2是否存在相互作用。结果:1)hPAQR7主要表达在人睾丸生殖细胞中,越靠近腔体的生殖细胞中表达越高,且老年人睾丸中hPAQR7含量降低,提示hPAQR7可能与精子功能有关;2)人成熟精子中能检测到hPAQR7转录本和蛋白,且hPAQR7为膜蛋白,主要定位于精子尾部;3)孕酮结合于人精子头部和尾部,hPAQR7能结合孕酮且结合孕酮的hPAQR7主要分布在人精子尾部;4)针对hPAQR7膜外段设计的hPAQR7单克隆抗体能显著抑制孕酮对人精子胞内钙含量增加以及对CatSper电流的激活效应,这提示hPAQR7可能通过介导孕酮激活CatSper通道所导致的钙信号变化,最终影响孕酮对人精子功能的调控过程;5)免疫共沉淀实验结果表明hPAQR7抗体可以与CatSper及ABHD2受体形成免疫复合物,此结果表明hPAQR7与CatSper、ABHD2受体间存在相互作用,而这进一步暗示hPAQR7-CatSper-ABHD2在人精子中形成复合物调控人精子孕酮非基因组效应;6)临床样本筛查结果表明,男性不育病人中有42%病例精子响应孕酮能力下降(钙信号和CatSper电流),且在这些男性不育病例中50%以上hPAQR7含量降低。这表明hPAQR7含量降低在精子响应孕酮能力下降类男性不育症中扮演重要角色。结论:综上所述,我们认为hPAQR7在介导人成熟精子响应孕酮过程中起到重要作用,且可能通过孕酮-hPAQR7-ABHD2-CatSper这一调控机制介导人精子孕酮非基因组效应。