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海豚链球菌（Streptococcusiniae）为β-溶血类链球菌，不属于任何Lancefield分群类型，目前报道有两种血清型(Ⅰ和Ⅱ)。该菌最早是在1976年亚马逊淡水河豚上发现的，是引起养殖鱼类发病的最强病原之一，已经在以色列、澳大利亚、日本和美国等多个国家引起爆发性疾病，对全球水产养殖造成严重经济损失。该菌具有广泛的宿主，对多种冷暖水鱼类具有致病能力，如虹鳟、罗非鱼、鲑鱼、澳洲肺鱼、黄狮鱼、比目鱼和鲈鱼等;同时，该菌也能感染其他动物和人类，特别是老年人和免疫力低下的人群，成为人们广泛关注的动物源人鱼共患传染病。然而目前关于海豚链球菌的致病机制和有效疫苗研究还处在初级阶段。
因此，本论文以海豚链球菌毒力因子α-enolase作为研究对象，探究了其在海豚链球菌致病过程中的潜在作用;评价了其交叉免疫保护能力;并研究了IFN-γ佐剂疫苗的免疫效应，初步探讨了其免疫诱导机制，以期提高疫苗的免疫效果，能够为海豚链球菌病的免疫防治提供新的思路。具体研究结果如下:
1.海豚链球菌α-enolase克隆、表达及生物学功能分析
以海豚链球菌DGX07菌株基因组DNA为模板，扩增α-enolase基因序列。生物信息学分析结果显示:海豚链球菌α-enolase完整ORF为1308bp，编码蛋白的氨基酸为435个，预测的蛋白质大小为47.24KDa(AccessionNo.AGT63054)。以海豚链球菌α-enolase氨基酸序列为目标，在NCBI中进行Blastp分析，发现多种链球菌的enolase氨基酸序列与海豚链球菌α-enolase具有很高的一致性。推测的活性位点包括:两个酶活性位点(205E，343K)，3个金属结合位点(242D，291E，318D;镁)，10个基质结合位点(155H，164E,291E，318D，343K，370-373SHRS，394K)和一个纤溶酶原结合位点(248-256FYDKERKVY)。同时，在海豚链球菌α-enolase氨基酸序列中预测到多个B细胞表位。然而，没有预测到信号肽切割位点和跨膜区域。进化树结果显示，原核生物和真核生物的enolase氨基酸序列分别位于不同的两簇，如人，鼠，牛，鸡和斑马鱼的序列聚为一簇，与原核生物表现出较远的遗传进化关系。在原核生物中，所有的链球菌聚为一簇，表现出较近的遗传进化关系。以上结果显示，海豚链球菌α-enolase与烯醇化酶的基因结构和功能活性位点一致。
2.重组α-enolase(rENO)对不同血清型海豚链球菌感染斑点叉尾鮰的交叉免疫保护作用研究
采用随机片段多态性扩增引物对海豚链球菌DGX07，ATCC29177和ATCC29178基因组DNA进行了扩增。结果显示，三组菌株基因组DNA均能扩增出多条DNA片段，大小主要集中在750-2000bp左右，DGX07和ATCC29178（血清Ⅰ型）均能扩增出一条约750bp左右的条带，而ATCC29177（血清Ⅱ型）却不能扩增出此条带，证明海豚链球菌DGX07为血清Ⅰ型菌株。氨基酸序列比对结果显示，DGX07与不同血清型海豚链球菌α-enolase氨基酸序列的一致性和相似性均在99％以上，同时与无乳链球菌的α-enolase氨基酸序列也具有很高的一致性和相似性（分别为96.6％和98.2％），但是与鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌的α-enolase氨基酸序列的一致性和相似性较低，分别只有50％和70％左右。Western-blot结果显示，兔抗rENO血清能够与不同血清型海豚链球菌的α-enolase进行反应，而且还能够结合无乳链球菌的α-enolase，但不能与鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌的α-enolase反应。免疫保护效果分析显示，免疫组抗体水平从7d开始增加，14d到达峰值，28d开始下降，但是仍然保持较高水平，56d抗体水平和未免疫组无差异;交叉免疫保护率结果显示，血清Ⅰ型菌株攻毒后rENO免疫组相对保护率为45.0％，血清Ⅱ型菌株攻毒后rENO免疫组相对保护率为44.4％。以上结果显示，海豚链球菌α-enolase在链球菌中高度保守，且具有对海豚链球菌血清Ⅰ型和Ⅱ型株菌株的交叉免疫保护性。
3.重组α-enolase(rENO)与重组斑点叉尾鮰干扰素-γ(rIFN-γ)佐剂疫苗的构建及免疫保护作用研究
以斑点叉尾鮰头肾组织cDNA作为模板，克隆了斑点叉尾鮰IFN-γ基因。经生物信息学分析显示:斑点叉尾鮰IFN-γ完整ORF为528bp，编码蛋白的氨基酸为175个，预测的蛋白质大小为20.74KDa;第20和21个氨基酸之间有一个信号肽切割位点;无跨膜区域。将克隆的IFN-γ氨基酸序列在NCBI中进行BLASTP比对，得到多个相似序列，其中与已经公布的斑点叉尾鮰IFN-γ2a(NP_001187231.1)和IFN-γ2b(NP_001187263.1)具有较高的一致性和相似性，分别为98.3％/98.3％和100％/100％;而与斑点叉尾鮰的IFN-γ1(NP_001187146.1)序列一致性和相似性较低(19.1％/38.7％)。进化树结果显示硬骨鱼类IFN-γ分布于同一支，其他脊椎动物分布于另外一支;克隆的斑点叉尾鮰IFN-γ与已公布的斑点叉尾鮰IFN-γ2a和IFN-γ2b聚为一簇。因此，本研究克隆的IFN-γ基因为斑点叉尾鮰IFN-γ2b。然后将斑点叉尾鮰IFN-γ成熟段(约18.17KDa)进行原核表达，得到可溶性表达融合蛋白rIFN-γ（约38KDa）。以重组rIFN-γ刺激分离的斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞，然后用荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。结果显示:LPS和rIFN-γ刺激斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞24h，均能够显著上调IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ和STAT1的表达(p＜0.05)，同时rIFN-γ也能够刺激NOS2b小幅度表达上调;而对照组和pET32a融合标签蛋白不能诱导相关免疫基因表达(p＞0.05)。以上结果显示，克隆的斑点叉尾鮰IFN-γ2b具有免疫调节功能，能够用于佐剂疫苗研究。
4.海豚链球菌α-enolase和斑点叉尾鮰IFN-γ串联DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究
通过融合PCR将IFN-γ基因与α-enolase基因串联，并在中间加入了两组柔性Linker(GlyGlyGlyGlySer)2，将融合片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体，得到重组真核表达质粒pcDNA3.1-ENO、pcDNA3.1-IFN-γ和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO。将构建的真核质粒转染到EPC细胞，细胞免疫荧光检测显示pcDNA3.1转染EPC细胞组未检测到绿色荧光信号，pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA3.1-ENO和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO转染的EPC细胞均检测到荧光信号，证明重组真核质粒均能够在EPC细胞里面进行表达。将构建好的真核质粒以肌肉注射的方式免疫斑点叉尾鮰，取免疫后第14天注射部位肌肉组织和肾脏组织进行免疫组织化学分析，结果显示在重组质粒注射组的肌肉细胞和肾脏巨噬细胞中均能够检测到阳性信号，而在对照组未观察到阳性信号。说明重组质粒在斑点叉尾鮰组织中能够表达。免疫指标检测结果显示:串联DNA疫苗pcDNA3.1-IFN-γ-ENO能够增强斑点叉尾鮰的ACH50活性和溶菌酶活性(p＜0.05)，而且能够持续刺激斑点叉尾鮰在免疫后56d仍保持较高水平的ACH50活性和溶菌酶活性;DNA疫苗抗体水平显著高于对照组(p＜0.05)，且IFN-γ能够提高串联DNA疫苗的抗体水平(p＜0.05);pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA-3.1-ENO和pcDNA-3.1-IFN-γ-ENO均能够在免疫后7d刺激IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ、STAT1和NOS2b基因的表达上调(p＜0.05)，在14d或者28d左右达到最高值，攻毒后48h显著下调NOS2b基因的表达;pcDNA3.1、pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA3.1-ENO和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO在第四周的相对保护率分别为:0％、15％、75％和85％，而各组在第八周的相对保护率分别为:0％、0％、45％和60％。以上结果显示，串联DNA疫苗pcDNA3.1-IFN-γ-ENO能够显著增强斑点叉尾鮰的非特异性免疫应答，诱导抗体产生和IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ、STAT1和NOS2b基因的表达，提高免疫保护率，且具有较长的免疫保护效果，具有开发成为一种高效经济的佐剂疫苗的潜力。
因此，本论文以海豚链球菌毒力因子α-enolase作为研究对象，探究了其在海豚链球菌致病过程中的潜在作用;评价了其交叉免疫保护能力;并研究了IFN-γ佐剂疫苗的免疫效应，初步探讨了其免疫诱导机制，以期提高疫苗的免疫效果，能够为海豚链球菌病的免疫防治提供新的思路。具体研究结果如下:
1.海豚链球菌α-enolase克隆、表达及生物学功能分析
以海豚链球菌DGX07菌株基因组DNA为模板，扩增α-enolase基因序列。生物信息学分析结果显示:海豚链球菌α-enolase完整ORF为1308bp，编码蛋白的氨基酸为435个，预测的蛋白质大小为47.24KDa(AccessionNo.AGT63054)。以海豚链球菌α-enolase氨基酸序列为目标，在NCBI中进行Blastp分析，发现多种链球菌的enolase氨基酸序列与海豚链球菌α-enolase具有很高的一致性。推测的活性位点包括:两个酶活性位点(205E，343K)，3个金属结合位点(242D，291E，318D;镁)，10个基质结合位点(155H，164E,291E，318D，343K，370-373SHRS，394K)和一个纤溶酶原结合位点(248-256FYDKERKVY)。同时，在海豚链球菌α-enolase氨基酸序列中预测到多个B细胞表位。然而，没有预测到信号肽切割位点和跨膜区域。进化树结果显示，原核生物和真核生物的enolase氨基酸序列分别位于不同的两簇，如人，鼠，牛，鸡和斑马鱼的序列聚为一簇，与原核生物表现出较远的遗传进化关系。在原核生物中，所有的链球菌聚为一簇，表现出较近的遗传进化关系。以上结果显示，海豚链球菌α-enolase与烯醇化酶的基因结构和功能活性位点一致。
2.重组α-enolase(rENO)对不同血清型海豚链球菌感染斑点叉尾鮰的交叉免疫保护作用研究
采用随机片段多态性扩增引物对海豚链球菌DGX07，ATCC29177和ATCC29178基因组DNA进行了扩增。结果显示，三组菌株基因组DNA均能扩增出多条DNA片段，大小主要集中在750-2000bp左右，DGX07和ATCC29178（血清Ⅰ型）均能扩增出一条约750bp左右的条带，而ATCC29177（血清Ⅱ型）却不能扩增出此条带，证明海豚链球菌DGX07为血清Ⅰ型菌株。氨基酸序列比对结果显示，DGX07与不同血清型海豚链球菌α-enolase氨基酸序列的一致性和相似性均在99％以上，同时与无乳链球菌的α-enolase氨基酸序列也具有很高的一致性和相似性（分别为96.6％和98.2％），但是与鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌的α-enolase氨基酸序列的一致性和相似性较低，分别只有50％和70％左右。Western-blot结果显示，兔抗rENO血清能够与不同血清型海豚链球菌的α-enolase进行反应，而且还能够结合无乳链球菌的α-enolase，但不能与鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和鲁氏耶尔森氏菌的α-enolase反应。免疫保护效果分析显示，免疫组抗体水平从7d开始增加，14d到达峰值，28d开始下降，但是仍然保持较高水平，56d抗体水平和未免疫组无差异;交叉免疫保护率结果显示，血清Ⅰ型菌株攻毒后rENO免疫组相对保护率为45.0％，血清Ⅱ型菌株攻毒后rENO免疫组相对保护率为44.4％。以上结果显示，海豚链球菌α-enolase在链球菌中高度保守，且具有对海豚链球菌血清Ⅰ型和Ⅱ型株菌株的交叉免疫保护性。
3.重组α-enolase(rENO)与重组斑点叉尾鮰干扰素-γ(rIFN-γ)佐剂疫苗的构建及免疫保护作用研究
以斑点叉尾鮰头肾组织cDNA作为模板，克隆了斑点叉尾鮰IFN-γ基因。经生物信息学分析显示:斑点叉尾鮰IFN-γ完整ORF为528bp，编码蛋白的氨基酸为175个，预测的蛋白质大小为20.74KDa;第20和21个氨基酸之间有一个信号肽切割位点;无跨膜区域。将克隆的IFN-γ氨基酸序列在NCBI中进行BLASTP比对，得到多个相似序列，其中与已经公布的斑点叉尾鮰IFN-γ2a(NP_001187231.1)和IFN-γ2b(NP_001187263.1)具有较高的一致性和相似性，分别为98.3％/98.3％和100％/100％;而与斑点叉尾鮰的IFN-γ1(NP_001187146.1)序列一致性和相似性较低(19.1％/38.7％)。进化树结果显示硬骨鱼类IFN-γ分布于同一支，其他脊椎动物分布于另外一支;克隆的斑点叉尾鮰IFN-γ与已公布的斑点叉尾鮰IFN-γ2a和IFN-γ2b聚为一簇。因此，本研究克隆的IFN-γ基因为斑点叉尾鮰IFN-γ2b。然后将斑点叉尾鮰IFN-γ成熟段(约18.17KDa)进行原核表达，得到可溶性表达融合蛋白rIFN-γ（约38KDa）。以重组rIFN-γ刺激分离的斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞，然后用荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。结果显示:LPS和rIFN-γ刺激斑点叉尾鮰头肾巨噬细胞24h，均能够显著上调IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ和STAT1的表达(p＜0.05)，同时rIFN-γ也能够刺激NOS2b小幅度表达上调;而对照组和pET32a融合标签蛋白不能诱导相关免疫基因表达(p＞0.05)。以上结果显示，克隆的斑点叉尾鮰IFN-γ2b具有免疫调节功能，能够用于佐剂疫苗研究。
4.海豚链球菌α-enolase和斑点叉尾鮰IFN-γ串联DNA疫苗的构建及免疫保护效果研究
通过融合PCR将IFN-γ基因与α-enolase基因串联，并在中间加入了两组柔性Linker(GlyGlyGlyGlySer)2，将融合片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体，得到重组真核表达质粒pcDNA3.1-ENO、pcDNA3.1-IFN-γ和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO。将构建的真核质粒转染到EPC细胞，细胞免疫荧光检测显示pcDNA3.1转染EPC细胞组未检测到绿色荧光信号，pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA3.1-ENO和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO转染的EPC细胞均检测到荧光信号，证明重组真核质粒均能够在EPC细胞里面进行表达。将构建好的真核质粒以肌肉注射的方式免疫斑点叉尾鮰，取免疫后第14天注射部位肌肉组织和肾脏组织进行免疫组织化学分析，结果显示在重组质粒注射组的肌肉细胞和肾脏巨噬细胞中均能够检测到阳性信号，而在对照组未观察到阳性信号。说明重组质粒在斑点叉尾鮰组织中能够表达。免疫指标检测结果显示:串联DNA疫苗pcDNA3.1-IFN-γ-ENO能够增强斑点叉尾鮰的ACH50活性和溶菌酶活性(p＜0.05)，而且能够持续刺激斑点叉尾鮰在免疫后56d仍保持较高水平的ACH50活性和溶菌酶活性;DNA疫苗抗体水平显著高于对照组(p＜0.05)，且IFN-γ能够提高串联DNA疫苗的抗体水平(p＜0.05);pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA-3.1-ENO和pcDNA-3.1-IFN-γ-ENO均能够在免疫后7d刺激IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ、STAT1和NOS2b基因的表达上调(p＜0.05)，在14d或者28d左右达到最高值，攻毒后48h显著下调NOS2b基因的表达;pcDNA3.1、pcDNA3.1-IFN-γ、pcDNA3.1-ENO和pcDNA3.1-IFN-γ-ENO在第四周的相对保护率分别为:0％、15％、75％和85％，而各组在第八周的相对保护率分别为:0％、0％、45％和60％。以上结果显示，串联DNA疫苗pcDNA3.1-IFN-γ-ENO能够显著增强斑点叉尾鮰的非特异性免疫应答，诱导抗体产生和IL-1β1、TNF-α、MHCⅡ、STAT1和NOS2b基因的表达，提高免疫保护率，且具有较长的免疫保护效果，具有开发成为一种高效经济的佐剂疫苗的潜力。