心血管疾病(Cardiovascular Disease, CVD)是一类涉及心脏、动脉、静脉、微血管等循环系统的疾病。据2012年世界卫生组织统计报告显示，CVD致残、致死率远远高于癌症和艾滋病，成为危害人类健康的一大疾病。因此开展CVD的预防和治疗具有重要意义。除了传统的中西药物治疗、血管成形术、冠状动脉旁路移植术等机械疗法之外，再生医学领域中血管新生的治疗方案已逐渐成为世界生命科学领域研究的热点课题。其中，寻求适当的细胞来源并诱导其定向迁移到组织受损部位且有目的可控性的诱导其分化是目前血管再生医学所面临的重大挑战问题之一。　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多分化潜能的成体干细胞。由于其具有来源丰富、取材简单、增殖迅速、易于转染外源基因、低免疫抗原反应、以及不涉及伦理问题等优点，成为组织工程、细胞治疗研究的重点。目前已经有报道证明 MSCs具有归巢、迁移至组织受损部位并参与组织修复的特性。在该过程中 MSCs必然受到因血液、间隙流流动所产生的剪切力作用，然而流体剪切力对MSCs迁移、向内皮细胞(endothelial cells, ECs)分化的影响还少有报道，其中所涉及的力信号转导途径及分子机理也尚未明确。　　本文以人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs)为研究对象，利用流体剪切力加载装置对hMSCs施加不同水平的剪切力作用。采用划痕愈合实验法，结合倒置显微镜和三电荷耦合器件(three charge coupled device,3CCD)图像传感器实时观察和记录hMSCs在流体作用下的迁移行为，筛选促进 hMSCs迁移的剪切力加载条件；通过免疫荧光染色(immunofluorescence staining)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)方法检测促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases1/2, ERK1/2)、c-Jun氮-末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)、p38 MAPK以及 C-X-C趋化因子4型受体(C-X-C chemokine receptor type4, CXCR4)蛋白的表达情况；通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测 hMSCs中基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)的分泌水平；并且利用U0126、SP600125、SB203580、AMD3100分别抑制ERK1/2、JNK、p38 MAPK和CXCR4的表达，考察MAPK及SDF-1/CXCR4信号转导途径在剪切力促进hMSCs迁移过程中的作用。另一方面通过immunofluorescence staining和Western blotting方法考察剪切力作用后，hMSCs中ECs表面标记蛋白von Willebrand因子(von willebrand factor, vWF)、血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)及血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule, CD31)的表达情况；并且通过ELISA方法考察 hMSCs中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌情况；Western blotting方法检测磷酸化ERK1/2、JNK及p38 MAPK的表达情况，初步探寻剪切力诱导hMSCs向ECs分化的分子机理。　　主要研究工作和结果如下：　　①剪切应力对hMSCs迁移行为的影响　　分别选取0.2、0.5、1、2、4、6、8或10Pa共8组剪切力作用于hMSCs，采用划痕愈合实验法(划痕与流体方向垂直)，结合倒置显微镜和3CCD图像传感器并且通过Aquacosmos软件拍照，实时观察细胞迁移情况：0.2Pa剪切力显著促进hMSCs迁移，在作用3、6和10 h后划痕愈合率为相应静置对照组的1.59、1.4及1.09倍(p<0.05)。0.5Pa和1Pa剪切力组的划痕愈合率与对照组相比无明显差异。而2Pa剪切力组在作用3、6和10h后划痕面积仅分别愈合了8±6％、8±5%和15±5%，极显著低于相应静置对照组水平(p<0.01)。同样，4?10 Pa剪切力组中hMSCs的迁移能力也显著下降。实验结果表明：在本研究室采用的剪切力加载体系中，低水平剪切力(0.2 Pa)作用促进hMSCs迁移，中等强度剪切力(0.5 Pa和1 Pa)作用对 hMSCs的迁移能力无明显影响，而高水平剪切力(≥2 Pa)作用抑制细胞迁移。进一步统计分析划痕两侧上、下游细胞迁移速率发现，静止对照组上、下游hMSCs迁移速率无明显差异，而0.2Pa剪切力促进下游细胞迁移，速率明显高于对照组下游细胞的迁移速率(p<0.05)。剪切力组上游细胞的迁移速率相对于对照组细胞没有明显差异。　　②MAPK在剪切力调节hMSCs迁移行为中的表达　　通过immunofluorescence staining和Western blotting方法定性定量检测0.2 Pa和2 Pa剪切力作用后hMSCs中磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2, p-ERK1/2)、JNK(phospho-JNK, p-JNK)及p38 MAPK(phospho-p38 MAPK, p-p38 MAPK)的表达情况：与对照组相比，0.2 Pa剪切力组中p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK的表达显著提高，达到最高值时分别为相应对照组表达水平的5.53、4.06和3.74倍(p<0.05)，而2 Pa剪切力组中未见其活化。利用U0126、SP600125及SB203580分别抑制p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK的表达后发现：抑制剂处理在不同程度上抑制了细胞迁移。U0126作用后剪切力组细胞划痕愈合率显著低于未添加抑制剂组的划痕愈合率(p<0.05)。然而，与添加抑制剂的静止对照组相比，剪切力在作用6 h后仍显著促进细胞迁移，划痕愈合率为静止对照组的1.48倍(p<0.05)，10 h后小幅下调至1.21倍，但仍具有极显著性差异(p<0.01)。提示除了ERK1/2，其它信号分子也可能参与介导了低剪切力对 hMSCs迁移的促进作用。SP600125和SB203580处理后完全抑制了细胞迁移。进一步分析p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK在上、下游hMSCs中的表达情况发现：下游细胞中p-ERK1/2和p-JNK的表达早于上游细胞。剪切力作用60 min后，其表达分别为上游细胞的2.39倍(p<0.05)和1.65倍(p=0.07)；120 min后上游细胞p-ERK1/2和p-JNK的表达才明显增加。上、下游细胞中p-p38 MAPK的表达均在剪切力作用30 min后显著提高，但上游细胞p38 MAPK的表达迅速失活且在剪切力作用60 min后下降至对照组水平。U0126、SP600125和SB203580分别处理后发现：SP600125同时抑制了上、下游hMSCs迁移，细胞迁移速率与未经抑制剂处理的剪切力组相比均具有显著性差异，而U0126和SB203580处理后仅抑制了下游细胞的迁移速率(p<0.05)，上游细胞的迁移速率并未受到抑制且与未经抑制剂处理的剪切力组相比无显著性差异。以上实验结果提示p-ERK1/2、p-JNK和p-p38 MAPK在上、下游hMSCs中表达模式不同可能是导致下游细胞迁移速率快于上游细胞的原因。　　③SDF-1/CXCR4在低剪切力促进hMSCs迁移行为中的表达　　利用ELISA方法分析剪切力作用后hMSCs中SDF-1的分泌情况。结果显示hMSCs在0.2 Pa剪切力作用3、6和12 h且继续静止培养24 h后，SDF-1的分泌量迅速上升至1.00±0.34、0.89±0.25和0.75±0.25 ng/mL，分别为对照组(静止培养48 h组)的3.25(p<0.01)、2.90(p<0.05)和2.43倍(p<0.05)；剪切力作用24 h且继续静止培养24 h后，SDF-1的分泌量回落至对照组水平。此外，0.2 Pa剪切力提高划痕上、下游细胞中SDF-1受体CXCR4的表达。剪切力作用3 h和6 h后，上、下游细胞CXCR4的表达量分别为对照组的1.23倍、1.19倍(3 h，p<0.05)和1.27倍、1.49倍(6 h，p<0.05)。利用AMD3100阻碍SDF-1与CXCR4结合后，抑制了低剪切力对 hMSCs迁移的促进作用，且下调了低剪切力激活的p-JNK和p-p38 MAPK的表达，却不影响剪切力对ERK1/2信号分子活化的促进作用。　　④剪切应力对hMSCs向ECs分化的影响　　分别对hMSCs施加0.2 Pa或2 Pa剪切力刺激，作用2天且静止培养1、3或5天后，通过immunofluorescence staining方法考察hMSCs中ECs表面标记蛋白vWF、VE-cadherin和CD31的表达。实验结果表明：2 Pa剪切力作用2天且静止培养5天后，细胞质内vWF以及细胞与细胞连接处VE-cadherin和CD31的表达高于其他实验组。进一步通过Western blotting方法定量考察三种表面标记蛋白的表达情况：hMSCs在2 Pa剪切力作用2天且静止培养5天后，vWF、VE-cadherin和CD31的表达量显著提高，分别为对照组(静止培养7天)表达量的2.34(p<0.01)、14.04(p<0.05)和3.35倍(p<0.01)。而0.2 Pa剪切力作用不能诱导hMSCs向ECs分化。　　⑤高水平剪切力促进hMSCs分泌VEGF、激活ERK1/2和JNK的表达　　利用ELISA方法考察剪切力作用后hMSCs中VEGF的分泌情况发现：hMSCs在2Pa剪切力作用2天且静止培养1、3或5天后，VEGF的分泌量迅速上升达到2.89±0.45、6.58±1.03和9.15±1.87 ng/mL，分别为对照组的1.84(p<0.05)、1.91(p<0.01)和1.81倍(p<0.01)。此外通过Western blotting方法检测hMSCs在2 Pa剪切力作用2天且静止培养1、3或5天后p-ERK1/2、p-JNK和p-p38 MAPK的表达情况：2 Pa剪切力作用2天且静止培养1天后，hMSCs中p-ERK1/2和p-JNK的表达量迅速上升至对照组的1.94倍(p<0.05)和2.34倍(p<0.05)。培养3天后，p-ERK1/2和 p-JNK的表达量下降至对照组水平。p38 MAPK在剪切力诱导hMSCs向ECs分化的过程中未被激活。提示在高水平剪切力作用诱导hMSCs向ECs分化的过程中，VEGF、ERK1/2和JNK可能起到调节作用。　　综合以上结论表明：低水平剪切力作用促进hMSCs迁移，高水平剪切力作用抑制hMSCs迁移却有诱导其向ECs分化的趋势。在低剪切力促进hMSCs迁移的过程中，SDF-1/CXCR4-JNK/p38 MAPK信号转导途径以及ERK1/2信号转导途径起到关键的调节作用；在高剪切力诱导hMSCs向ECs分化的过程中，ERK1/2、JNK信号分子的活化以及VEGF分泌量的迅速增加可能起到重要的介导作用。本研究对认识流体剪切力调节MSCs迁移、诱导其向内皮分化的分子基础及相关力信号转导途径具有重要意义，还可为临床上组织修复及组织再生工程中基于干细胞水平新的治疗方法的建立提供定量的参考依据。