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目的:越来越多的流行病学研究和分子研究证明,高尿酸血症可能是慢性肾脏病发生或进展至终末期肾病的独立危险因素。随着对高尿酸血症与肾脏损害关系及机制愈加深入的探究,高尿酸肾病已成为肾脏病领域研究的热点。然而,高尿酸肾病的代谢变化、肾脏损伤机制仍未阐明,降尿酸治疗的有效性也尚存争议。肾茶是在我国民间被广泛应用于泌尿系感染、尿路结石及慢性肾炎治疗的一种传统草药。许多研究已证实肾茶具有治疗高尿酸血症的功效,但其对于高尿酸肾病治疗效果及作用机理却鲜有报道。本研究通过对高尿酸肾病患者血液的代谢组学分析,探究高尿酸肾病患者的代谢特征;并通过肾茶治疗高尿酸肾病大鼠的实验研究,探究肾茶对高尿酸肾病大鼠的治疗效果及药效机制,本研究旨在进一步阐释高尿酸血症致肾脏损伤的分子机制,同时为肾茶在高尿酸肾病的临床应用提供理论依据。方法:1.代谢组学分析基于“中医体质与健康医学协同创新中心”项目的临床资料数据库,从生物标本库中筛选出符合高尿酸肾病诊断标准的血清样本30例,健康人群血清样本30例。采用超高效液相色谱-串联质谱测定法对血清样本进行代谢组学检测,分析高尿酸肾病患者与健康人群之间的差异代谢产物,探索其潜在生物标志物;结合其富集到的代谢过程、代谢通路及信号转导通路,分析高尿酸肾病患者肾损伤的潜在机制,并从中遴选相关通路在后续动物实验研究中进行验证。2.动物实验研究①高尿酸肾病大鼠模型的评价通过对高尿酸肾病动物模型相关文献的回顾分析,遴选出氧嗪酸钾联合尿酸灌胃的造模方式。将20只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组,模型A组,模型B组,模型C组,分别给予三个模型组大鼠含有低剂量(15mg/ml)、中剂量(30mg/ml)和高剂量(60mg/ml)尿酸的氧嗪酸钾(75mg/ml)混悬液,给予对照组大鼠0.3%羧甲基纤维素钠溶液灌胃,灌胃量均为10ml/kg,连续4周。灌胃3周后,获取大鼠血液样本,灌胃4周后获取大鼠血液及肾脏组织标本,分离出血清用于检测血尿酸、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇,将肾脏组织标本制成石蜡切片并进行苏木素-伊红染色,观察大鼠肾脏病理形态学变化。确定高尿酸肾病大鼠成模条件,为后续的肾茶干预研究做准备。②肾茶治疗高尿酸肾病的药效研究基于①中探索出的高尿酸肾病大鼠造模方法。将40只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组、高尿酸肾病模型组、肾茶低剂量组、肾茶高剂量组及别嘌呤醇组,采用边造模边干预的方式,每天上午给予对照组0.3%羧甲基纤维素钠溶液,其余各组给予造模药物。下午给予对照组、高尿酸肾病模型组纯水,分别给予肾茶低剂量组、肾茶高剂量组及别嘌呤醇组肾茶水煎剂3.125g/kg、肾茶水煎剂6.25g/kg及别嘌呤醇溶液50mg/kg。每次给药体积均为10ml/kg,灌胃5周。4周后,获取大鼠的血液标本,用代谢笼收集24h尿液标本。5周后,获取大鼠的血液标本、24h尿液标本及肾脏组织标本。上述标本分离出的血清用于检测血尿酸、尿素氮、血肌酐、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇,尿液上清用于检测尿尿酸、尿肌酐,并利用尿酸排泄分数公式估尿酸排泄情况:[(血肌酐×尿尿酸)/(血尿酸X尿肌酐)]×100%;肾脏组织标本制成石蜡切片并进行苏木素-伊红染色评估肾脏组织形态变化。③肾茶治疗高尿酸肾病的机制探讨基于高尿酸肾病患者血液代谢组学分析结果利用肾茶治疗高尿酸肾病药效研究中各组大鼠的肾组织,免疫组化法检测肾组织中CD68蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链反应法检测促炎细胞因子IL-1 β、IL-6、TNF-α及MCP-1的基因表达,酶联免疫吸附测定法检测肾组织中的IL-1 β蛋白表达,评估高尿酸肾病大鼠肾组织炎症以及肾茶对肾组织炎症的影响;利用蛋白质印迹法、免疫组化法对代谢组学研究所筛选出的潜在信号转导通路进行验证,并观察肾茶对通路的调控作用。结果:1.代谢组学结果显示:①潜在生物标志物:相比健康人群,高尿酸肾病患者有32种差异代谢产物,其中特征变量投影重要性值大于1的有18种,可作为潜在的生物标志物,包括:升高的有氧化型色氨酸/苯丙氨酸、氧化型酪氨酸、尿酸、乳酸、柠檬酸、4,6-二羟基喹啉、溶血磷脂酰胆碱(16:1)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、尿苷、富马酸、琥珀酸、草酸,降低的有谷胱甘肽、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽、亮氨酸、苯丙氨酸、3-羟基丁酸、左旋缬氨酸、L-色氨酸。②富集代谢过程及代谢通路:利用MetaboAnalyst4.0富集到28个代谢过程及21条代谢通路,它们分别是柠檬酸循环(TCA循环)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、丙酮酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、丁酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、乙醛酸和二元酸代谢、酮体的合成与降解、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、精氨酸生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、丙酸盐代谢、糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、嘧啶代谢、酪氨酸代谢、嘌呤代谢。③富集信号转导通路:利用Cytoscape2.5.3软件ClueGO富集到1942条通路,包括p38 MAPK信号通路、NIK/NF κB信号通路、ERK1/ERK2信号通路、免疫系统调节、IκB/NFκB信号通路、TNF信号通路、TGF β 1通路等,我们选择p38 MAPK及NFκB通路在动物实验研究中进行验证。2.动物实验结果显示:①给药诱导3周后,与对照组相比,尿素氮、血肌酐较对照组无显著变化(P>0.05),三个模型组的高密度脂蛋白胆固醇均显著升高(P<0.05),模型C组的总胆固醇及三个模型组的血尿酸水平均显著升高(P<0.05),;4周后,与对照组相比,三个模型组的血尿酸水平显著升高(P<0.05),三个模型组的尿素氮及模型A组的血肌酐无差异(P>0.05),模型B组、模型C组的血肌酐明显升高(P<0.05),模型B组的甘油三酯显著降低(P<0.05)。病理结果显示:模型A组中大鼠肾脏仅部分肾小管出现扩张,其病理评分与Con组之间差异无统计学意义(P>0.05),模型B组和模型C组的肾小管扩张更为严重,伴肾小管上皮萎缩、刷状缘减少、细胞核数目减少及炎症细胞浸润,它们的病理评分均显著高于Con组(P<0.01)。②肾茶水煎剂干预高尿酸肾病大鼠4周,与对照组相比,高尿酸肾病模型组大鼠的尿量变化不显著(P>0.05),血尿酸、尿素氮、血肌酐、尿尿酸、尿酸排泄分数及总胆固醇均显著升高(P<0.05);与高尿酸肾病模型组相比,肾茶高剂量组大鼠的尿量高于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05),肾茶低剂量及高剂量组的血尿酸、尿素氮、血肌酐变化不显著(P>0.05),肾茶高剂量组尿尿酸及尿肌酐较模型组均显著降低(P<0.05),别嘌呤醇组的血尿酸、尿素氮、总胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇显著降低(P<0.05)。干预5周,与对照组相比,高尿酸肾病模型组大鼠的尿量变化不显著(P>0.05),血尿酸、尿素氮、血肌酐、尿尿酸均显著升高(P<0.05),甘油三酯显著降低(P<0.05);与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量及肾茶高剂量组大鼠的血尿酸降低,但差异无统计学意义(P>0.05),肾茶低剂量组及肾茶高剂量组的尿素氮、血肌酐均出现显著降低(P<0.05),肾茶高剂量组尿尿酸显著降低(P<0.05),别嘌呤醇组的血尿酸显著降低而尿酸排泄分数显著升高(P<0.05)。病理结果显示,高尿酸肾病模型组肾小管明显扩张,伴肾小管上皮萎缩、刷状缘减少、细胞核数目减少及炎症细胞浸润,病理评分显著高于对照组(P<0.05),与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量组、肾茶高剂量组的大鼠肾脏病理损伤程度明显减轻,病理评分均显著降低(P<0.05),别嘌呤醇组大鼠的肾脏病理损伤无明显改善,病理评分与模型组间差异无统计学意义(P>0.05)。③肾茶水煎剂对高尿酸肾病大鼠肾脏炎症及相关调控通路p38 MAPK/NFκB蛋白表达的影响。免疫组化结果显示,与对照组相比,高尿酸肾病模型组大鼠肾间质中巨噬细胞浸润明显,CD68表达量显著升高(P<0.05),与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量、肾茶高剂量组及别嘌呤醇组大鼠肾间质巨噬细胞浸润均出现明显减少,CD68的表达均显著减少(P<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应检测结果显示,与对照组相比,高尿酸肾病大鼠肾组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1基因表达均显著升高(P<0.05),与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量组IL-1β的基因表达显著减少(P<0.05),肾茶高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1基因表达均显著减少(P<0.05),别嘌呤醇组IL-1 β、MCP-1的基因表达量显著减少(P<0.05)。酶联免疫吸附测定结果显示,与对照组相比,高尿酸肾病模型组大鼠肾组织IL-1β蛋白表达显著升高(P<0.05),肾茶低、高剂量组及别嘌呤醇组的IL-1 β蛋白表达均显著减少(P<0.05)。蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,高尿酸肾病大鼠肾组织总蛋白中的P-p38 MAPK、p-IκBα蛋白表达量及核蛋白中的P-NFκB含量均显著升高(P<0.05);与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量组、高剂量组及别嘌呤醇组大鼠肾组织总蛋白中的P-p38 MAPK、p-IκBα表达量以及核蛋白中的P-NFκB含量均显著降低(P<0.05)。免疫组化结果显示,与对照组相比,高尿酸肾病大鼠肾组织中的P-NFκ B表达量显著升高(P<0.05);与高尿酸肾病模型组相比,肾茶低剂量组、高剂量组及别嘌呤醇组大鼠肾组织中P-NFκB表达量显著降低(P<0.05)。结论:1.高尿酸肾病患者体内存在糖、脂、蛋白质代谢紊乱,主要涉及柠檬酸循环、糖酵解、脂肪酸代谢及氨基酸代谢等,并发现多个与氧化应激和肾脏损伤密切相关的潜在生物标志物。2.氧嗪酸钾(750mg/kg)联合中剂量(300mg/kg)、高剂量(600mg/kg)尿酸的混悬液诱导4周,可成功构建出高尿酸肾病大鼠模型。3.别嘌呤醇对高尿酸肾病大鼠的血尿酸具有改善作用,但对肾功能及肾脏病理损伤无明显改善;肾茶水煎剂可以保护高尿酸肾病大鼠肾功能并能改善其病理损伤。4.高尿酸肾病大鼠肾组织中p38 MAPK/NFκB通路激活,出现明显的肾脏炎症反应,肾茶水煎剂可通过抑制p38 MAPK/NFκB通路改善高尿酸肾病大鼠肾脏炎症反应。