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参考Wattier等(2000)的方法从坛紫菜叶状体中提取基因组DNA,并用CTAB/NaCl加以纯化,得到质量较高的DNA。经紫外分光光度计检测其OD260/OD280比值为1.89~1.95;琼脂糖凝胶电泳检测其大小约为23Kb且无RNA污染,适用于微卫星分子标记研究。根据胡则辉等(2006)报道的坛紫菜微卫星DNA序列设计特异引物,进行坛紫菜微卫星的PCR扩增反应。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳并采用Brant等(1991)的银染方法染色。结果表明,在所设计的25对引物中有7对扩增出了较好的DNA图谱,且仅有3对引物得到了3条可区分坛紫菜野生种及2个优良群体(生长快型、高蛋白型)的差异性条带:25#-231、14#-302和4#-117,其中25#-231与14#-302两差异条带经纯化、克隆及测序后,根据特征带的序列和原引物序列重新设计引物并进行PCR扩增反应,电泳结果表明这两条带确实可以作为生长快群体及野生种群体的特征分子标记。
本研究同时还使用15对微卫星引物对坛紫菜4个非养殖群体80个样品进行了遗传多样性分析,扩增的总位点数为39个,其中多态性位点为29个,占74.4%。在这4个群体中,平均有效等位基因数为1.3806(1.3233~1.5163),平均遗传杂合度为0.2593(0.2178~0.33 10),平均PIC值为0.4833(0.4808~0.4878)。结果表明,本实验所用的15个微卫星位点具有较丰富的多态性,显示了这4个坛紫菜非养殖群体的遗传多样性。用Popgen32软件构建4个坛紫菜群体间的Nei’s遗传距离矩阵,结果表明,4个坛紫菜群体的Nei’s遗传相似系数在0.8933~0.9617之间,Nei’s遗传距离在0.0390~0.1128之间。AMOVA结果说明坛紫菜遗传多样性主要体现在个体的遗传差异上。根据Nei’s遗传距离矩阵通过MEGA 4.0软件用UPGMA法构建4个坛紫菜群体间的聚类图。结果表明生长于平潭县同一岛上的阳面和阴面群体首先聚在一起,个体之间的遗传差异很小(相似系数高达0.9617),说明两群体之间的基因交流平凡,没有群体分化的现象出现,虽然它们在表型上差异很大。这同时也反映出不同的生境对坛紫菜叶状体形态会产生较大的影响。相对来说,泉州古浮生长的坛紫菜独立于其它的群体,它们的多态位点(33)、多态性(84.62%)、Shannon指数(0.4870)、有效等位基因数(1.5163)、预期杂合度(0.33 10)、PIC(0.4878)等值也是最大的,揭示这个群体可能更适合被用于杂交遗传育种的材料。