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猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)是引起妊娠母猪繁殖障碍的主要病原体之一,可引起初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪等,还可引起感染母猪不孕或反复发情,并普遍存在于国内外的养殖场,严重影响和制约着养猪业的发展。细胞因子(Cytokine,CK)是由免疫细胞和某些非免疫细胞活化后产生的高活性多功能的小分子多肽、糖蛋白或蛋白,具有调节炎症反应和免疫应答、抗肿瘤和抗病原微生物感染等多种生物学功能。为了进一步了解猪细胞因子对PPV感染的免疫反应机制,更深入的阐明PPV的致病机理,进行了以下研究:1利用实时定量PCR分别对PPV感染PK-15细胞后1 h、2 h、3 h、12 h、24 h、48 h、72 h细胞中的PPV DNA水平以及1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h时细胞中的IFN-β、IFN -γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、2-5OAS、RNaseL和IRF-3等干扰素及相关细胞因子mRNA分泌水平进行检测,结果发现,PPV感染PK-15细胞后1 h即能检测到PPV DNA,12 h后PPV开始迅速增殖,在感染后48 h达到峰值,为1800倍左右。IFN-β、IFN -γ、IFNAR-2、MHC-Ⅰ、iNOS表达量在感染后1 h并未见增加,但在2 h时增加明显,其中IFNAR-2达到未感染时的21倍左右,随后表达水平逐步降低;IFNAR-1在1 h时基因表达量开始增加,在2 h达到高峰,随后表达水平开始下降;MHC-Ⅱ、Mx1表达在感染后12 h显著增加,其中Mx1基因在24 h表达量达到8423倍,此后迅速下降;2-5OAS、RNaseL在48 h达到高峰,其它时间表达差异不显著;IRF-3在感染后1 h表达量显著增加,达到97倍,在2 h和12 h仍增加显著,48 h之后降低。2利用实时定量PCR分别对PPV感染PK-15细胞后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h的细胞中的TNF-α、TNFR2、Bcl-2、Bcl-xl、FasL、p53、Caspase-8和PBR等凋亡相关细胞因子mRNA分泌水平进行检测,结果发现PPV感染PK-15细胞后TNF-α在2 h表达量明显增加,达到15倍,随着时间的延长表达量降低,在96 h后表达量变化不显著;TNFR2在2 h表达量显著增加,自12 h后表达量降低明显;Bcl-2 mRNA从12 h到48 h表达量明显增加,96 h后变化不显著;Bcl-xl在2 h时表达量显著增加,达到9.6倍,随后逐渐降低;FasL在12 h表达量增加显著,24 h后表达量下降显著;2 h时p53的表达量显著增加,24 h后表达量变化不明显;2 h时Caspase-8表达量显著增加,达到1.97倍,随后逐渐降低;PBR表达量从2 h开始增加,24 h达到41倍之多,随后表达量开始下降。3利用实时定量PCR分别对PPV感染PK-15后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h的细胞中的IL-1β、2、6、8、10、12p35、12p40、13、15、17和18等炎性细胞因子mRNA分泌水平进行检测,结果发现PPV感染PK-15细胞后在1 h时IL-1β、IL-8、IL-12P40的表达量明显增加,在2 h时达到峰值,分别达到33倍、8倍、32倍;IL-6的表达量在1 h显著增加,达到19倍,12 h后变化不显著;IL-12P35表达量1 h时开始增加,12 h达到峰值;IL-13在2 h时表达量增加显著,随后逐渐下降;IL-17在PPV感染后表达量显著下降,甚至低于对照组细胞的表达量;IL-18基因在2 h表达量即显著增加,随后持续稳定高效表达。PK-15细胞不分泌IL-2、IL-10及IL-15。4利用实时定量PCR分别对PPV感染PK-15后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h、96 h细胞中MIP-1α、TGF-β1、PGK1和MURR1分泌水平进行检测,结果发现MIP-1α在感染后1 h表达量即显著增加,在2 h达到峰值,基因表达量差异倍数为13倍;TGF-β1在感染后96 h表达变化量达到8.8倍,而在其余时间点检测结果均无显著变化;PGK1在感染后2 h的表达量即达到95倍之多,随后开始下降,但仍高于对照组细胞的基因表达量;MURR1在感染后2 h即开始大量表达,12 h达到81倍,24 h迅速达到301倍,48 h时仍为对照组细胞的基因表达量的12倍,至96 h无显著变化。5利用实时定量PCR分别对不同感染复数PPV感染PK-15后1 h、2 h、12 h、24 h、48 h细胞中的IFN-β、IRF-3、TNF-α和IL-18分泌水平,结果发现IFN-β在感染后1 h表达量开始增加,当12 h且MOI=1时表达量增加显著,达到11倍,此后开始下降;IRF-3在感染后1 h表达量显著增加,在1 h且MOI=10时表达量达到967倍;TNF-α在1 h时表达量开始增加,在2 h且MOI=1时表达量的差异倍数达到96,48 h时表达量开始下降;IL-18从1 h到48 h持续表达,在24 h且MOI=1时表达差异倍数达到64倍。综上所述,本试验分别对PPV的增殖规律,干扰素及相关细胞因子、凋亡相关细胞因子、炎性细胞因子、部分抗病毒基因及不同感染复数的PPV感染后PK-15部分细胞因子的转录时相进行了研究,为进一步了解细胞因子的免疫学作用机理及PPV的分子作用机制提供试验依据,为预防和治疗PPV相关药物的筛选及研制奠定了理论基础。