高血压是一种常见的由多因素引起的慢性病，也是脑卒中、心力衰竭、肾衰竭等心脑血管疾病的重要危险因素。全世界范围内有将近14亿人患有高血压，其中约有900万人死于高血压并发症，所以高血压的防治是全世界所面临的重要公共健康问题。几十年来，国内外学者对高血压病进行了广泛而深入的研究，同时也取得了诸多进展，但高血压的发病机制极其复杂，迄今尚未被完全阐明。目前已知的主要发病机制包括交感神经亢奋、血管功能紊乱、水钠潴留等，因此明确血压的调控机制对高血压的防治有着重要的意义。肌浆网/内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA）2是体内分布最广的SERCA亚型，通过水解ATP将胞浆内Ca2+转运至肌浆网和内质网中，维持细胞内的钙稳态。SERCA2674位点的半胱氨酸（cysteine674,C674）是重要的氧化还原位点。C674上的巯基在一氧化氮的作用下可以发生谷胱甘肽化从而增加SERCA2的活性。在高血压易感环境下如衰老、糖尿病、动脉粥样硬化等，大量的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）生成会导致C674的不可逆氧化增加，造成这一氧化还原位点的失活。血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）是常用的高血压模型诱导剂，我们发现在Ang II诱导的高血压小鼠肾皮质中C674不可逆氧化显著增加，推测病理情况下C674的失活参与了高血压的发生和发展。关于C674是否参与血压调控尚无报道，本论文主要探讨SERCA2C674的失活是否引起血压增高及可能参与的分子机制，并初步针对这些分子机制的相关靶点进行药物干预，探讨它们在高血压治疗中的作用。
　　我们在C57BL/6J背景的小鼠上构建了SERCA2C674S基因敲入小鼠（SERCA C674knock-in mice,SKI）来模拟病理情况下C674的失活，目的是探讨C674失活与血压调控的关系及机制。与WT（wild type,WT）小鼠相比，SKI小鼠血压明显升高并且24小时尿量和尿钠排泄减少，推测C674失活可能通过引起水钠潴留导致血压升高。Na+/K+-ATP酶是肾脏近曲小管（renal proximal tubule,RPT）上皮细胞中调控水钠重吸收的关键酶，它的活性增加引起水钠潴留。组织学显示SKI小鼠肾脏并未出现器质性的病变，但其RPT上皮细胞的Na+/K+-ATP酶活性较WT小鼠明显增强，提示C674失活导致的血压增加是由肾脏功能性改变引起的，与组织结构病变无关。为了探索C674失活对肾脏SERCA2功能的影响，我们分别检测WT小鼠和SKI小鼠肾皮质中SERCA2的mRNA和蛋白表达水平，结果显示SERCA2a和SERCA2b的mRNA表达水平在两组间没有明显的差异，但SERCA2b的mRNA表达相对拷贝数是SERCA2a的100多倍，说明SERCA2b是肾皮质中SERCA2的主要变异体。SERCA2的蛋白表达水平组间没有差异。SKI小鼠RPT细胞的胞内Ca2+浓度较WT小鼠明显增加，说明RPT细胞C674的失活虽然不影响SERCA2的表达水平，但是导致SERCA2的功能障碍。SERCA2的功能障碍干扰胞内Ca2+向内质网的转运，引起内质网钙库减少，持续的内质网钙库减少诱导内质网应激。在肾皮质和RPT细胞，我们检测了内质网应激相关标志物的蛋白表达，发现磷酸化蛋白激酶R样ER激酶（phospho-protein kinase R-like ER kinase,p-PERK）、免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin binding protein,BIP）、活化转录因子6（activating transcription factor6,ATF6）以及转录因子C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的蛋白表达水平在SKI小鼠相比WT小鼠均显著上调。利用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate,4-PBA）进行体内干预，我们发现抑制内质网应激可以降低SKI小鼠的水钠潴留及血压，但对WT小鼠没有影响。4-PBA逆转SKI小鼠RPT细胞中增强的Na+/K+-ATP酶活性。这些结果说明C674失活引起的内质网应激参与了水钠潴留和血压升高，可能与其增强RPT细胞的Na+/K+-ATP酶活性有关。为了探索引起SKI小鼠水钠潴留的分子调控机制，我们用qPCR法在肾皮质中筛选水钠调控相关基因的mRNA表达水平，这其中可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase,sEH）在SKI小鼠表达增加，而多巴胺D1受体（dopamine D1receptor,D1R）在SKI小鼠表达降低。免疫印迹、免疫组化及细胞免疫荧光实验进一步证实肾皮质和RPT细胞中C674失活增加sEH的蛋白表达水平，降低D1R的蛋白表达水平。sEH增加Na+/K+-ATP酶活性而D1R抑制Na+/K+-ATP酶活性。C674失活引起的sEH增加和D1R降低可以共同增加RPT细胞Na+/K+-ATP酶的活性。为了进一步研究由C674失活引起的内质网应激与sEH和D1R的关系，我们分别在WT小鼠和SKI小鼠的RPT细胞中加入4-PBA进行干预。4-PBA部分降低WT小鼠内质网应激标志物蛋白表达，但对sEH和D1R没有影响。在SKI小鼠，4-PBA降低p-PERK、BIP、ATF6、CHOP以及sEH的蛋白表达，增加D1R的蛋白表达，说明内质网应激通过调控其下游的sEH和D1R来影响水钠排泄和血压。为了探索sEH在SKI小鼠血压升高中的作用，我们在RPT细胞上给予sEH抑制剂1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl)urea（TPPU）来抑制sEH的活性。TPPU在WT小鼠和SKI小鼠均不影响sEH的蛋白表达水平。在WT小鼠的RPT细胞，TPPU不影响内质网应激相关蛋白和D1R的表达。在SKI小鼠的RPT细胞，TPPU降低内质网应激标志物p-PERK、BIP、ATF6和CHOP蛋白表达，增加D1R蛋白表达，提示内质网应激和sEH可以相互调控，但二者都位于D1R的上游。与4-PBA类似，TPPU的体内干预并不影响WT小鼠的血压，但TPPU恢复SKI小鼠的尿钠排泄和降低血压。TPPU逆转SKI小鼠RPT细胞中增强的Na+/K+-ATP酶活性。这些结果表明上调的sEH是SKI小鼠血压升高的重要原因。为了明确上调的sEH引起SKI小鼠血压增加的机制，我们在大鼠RPT细胞系中过表达sEH。sEH过表达上调内质网应激标志物BIP、ATF6和CHOP的蛋白表达，下调D1R的蛋白表达，进一步证明sEH和内质网应激可以相互调控，共同抑制D1R。由于SERCA2的基本功能是维持胞浆钙稳态和内质网钙稳态，我们推测SKI小鼠中内质网应激位于sEH的上游，而上调的sEH可以进一步加剧内质网应激，共同抑制了D1R，增加了Na+/K+-ATP酶的活性。我们在大鼠RPT细胞系中分别过表达SERCA2b C674和SERCA2b S674，确证了C674失活对内质网应激、sEH和D1R的直接调控。
　　高血压的防治是全世界关注的医学热点。目前市场上首选的抗高血压药物主要有以下五类，即利尿药、β受体阻断药、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂和血管紧张素II受体1型阻断药。随着逐年上升的高血压患病率以及现阶段较低的高血压控制率，科研工作者仍需深入研究高血压的发病机制以及对应的治疗药物。利用SKI小鼠有自发性血压增加的优势，我们初步探讨SERCA激动剂CDN1163和[6]-Gingerol在高血压治疗中的作用。在SKI小鼠的RPT细胞，CDN1163和[6]-Gingerol均降低胞内Ca2+浓度，抑制部分内质网应激相关蛋白和sEH的表达，增加D1R蛋白的表达，降低Na+/K+-ATP酶活性。CDN1163和[6]-Gingerol的体内干预实验均改善SKI小鼠的水钠潴留和血压增高。
　　综上所述，本课题首次证实SERCA2中C674的氧化还原状态是血压调控的关键。病理情况下C674失活通过引起水钠潴留导致血压升高。在肾脏，C674失活通过诱导内质网应激和sEH，下调D1R的蛋白表达，增强RPT细胞Na+/K+-ATP酶的活性，最终导致水钠潴留和血压升高。利用SKI小鼠作为高血压模型，初步探讨4-PBA、TPPU、CDN1163以及[6]-Gingerol在抗高血压中的作用，我们发现抑制sEH活性和内质网应激以及激活SERCA的活性都有可能成为高血压治疗的干预措施。