宿主蛋白CBF-β调控灵长类动物慢病毒Vif蛋白功能的生化机制研究

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慢病毒能引起人或多种动物长期性、进展性免疫缺陷综合征(AIDS)。常见慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、梅迪维斯纳病毒(MVV)以及唯一不编码病毒感染性因子(Vif)的马传染性贫血病毒(EIAV)。除了EIAV驴白细胞弱毒疫苗具有广谱、高效的保护作用,FIV灭活疫苗对部分FIV毒株具有保护,目前其余慢病毒均没有安全、有效的疫苗。因此,抗病毒治疗成为对抗慢病毒,特别是HIV引起的艾滋病的有效方式。目前能有效抑制HIV-1复制的药物主要是病毒酶类抑制剂,它们通过结合和抑制病毒生命周期中的多种酶类,来治疗艾滋病。但是由于毒株的进化和突变,耐药性毒株逐渐出现,提示我们找到新的抗病毒靶点尤为急迫。在HIV-1的多类靶细胞中表达天然免疫限制因子APOBEC3蛋白家族成员。APOBEC3通过诱导病毒基因组产生致死性突变来抑制包括HIV-1在内的慢病毒复制。慢病毒的Vif蛋白通过诱导APOBEC3的降解协助病毒清除细胞内不利环境。近年的研究表明,HIV-1 Vif在诱导APOBEC3降解的时候需要细胞内的转录辅因子CBF-β的协助。干扰CBF-β的表达抑制了HIV-1 Vif的功能,进而促进了APOBEC3对HIV-1的抑制。因此,打断CBF-β与HIV-1 Vif的相互作用成为新的治疗艾滋病的靶点。而精细剖析CBF-β对HIV-1 Vif作用的生化机制有助于抗病毒药物的设计和合成。本研究首先建立了稳定干扰CBF-β表达的293T细胞系,从常见动物慢病毒Vif蛋白着手,分析Vif诱导APOBEC3蛋白降解时是否需要CBF-β的辅助。结果发现只有灵长类动物慢病毒Vif蛋白发挥功能时需要CBF-β的辅助,而非灵长类动物慢病毒Vif蛋白不需要CBF-β的辅助即能诱导相应物种APOBEC3降解。随后对CBF-β调控灵长类动物慢病毒Vif蛋白的生化特性进行了多方面的分析。以非灵长类动物慢病毒Vif蛋白为对比工具,发现过表达CBF-β改变了灵长类动物慢病毒Vif蛋白在细胞内的多重生化特性。结合蔗糖密度梯度离心实验,CHX细胞内蛋白稳定性实验和激光共聚焦显微镜观察发现,CBF-β过表达增强了灵长类动物慢病毒Vif蛋白在细胞内的稳定性、延长其半衰期、减少其细胞内寡聚化程度、改变其细胞内分布模式等。虽然初步的研究发现CBF-β特异性调控灵长类动物慢病毒Vif蛋白的多重生化特性,但是对哪些生化特性的影响决定CBF-β对灵长类动物慢病毒Vif蛋白功能的调控并不清楚,因此,结合已有的报导,在本研究中选取了一些对Vif或者CBF-β功能重要的氨基酸,进行了相应氨基酸的突变实验,再来分析CBF-β过表达对灵长类动物慢病毒Vif蛋白生化特性的改变。通过分析Vif或者CBF-β的功能缺失体,发现CBF-β与灵长类动物慢病毒Vif蛋白进行相互作用,改变其细胞内分布模式,影响其细胞内寡聚化程度只是CBF-β调控灵长类动物慢病毒Vif蛋白功能的前提条件。CBF-β通过结合功能域与Vif结合后,再通过包含第68位氨基酸在内的调节功能域对Vif进行构象改变、增强其细胞内稳定性与CBF-β增强灵长类动物慢病毒Vif蛋白功能密切相关。因此我们首次提出CBF-β通过“结合-调控”这样的两步作用机制辅助Vif功能的观点。接下来,本研究探索了CBF-β促进HIV-1 Vif蛋白稳定性的分子机理。本研究发现CBF-β通过结合HIV-1 Vif蛋白,抑制了其多个赖氨酸位点的聚泛素化修饰,进而减少其在细胞内通过蛋白酶体途径的降解,增强Vif蛋白在细胞内的稳定性。
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