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无论是植物的生长发育过程,还是抵御病原入侵的过程都与极性胞吐作用紧密相关。植物Exocyst复合体在胞吐作用中行使重要功能。已有很多实验结果表明,模式植物拟南芥中,Exocyst复合体会影响花粉的萌发、花粉管的伸长,以及气孔开放等生理活动;其在细胞内移动的过程中会与植物激素的一些转运蛋白相结合,共同调控植物激素的运输与分布。近年来,EXPO这一双膜Exocyst结构的发现,使得人们对植物Exocyst复合体的研究更进一步。Exocyst复合体在生长发育和病原菌防御反应中的作用,其与细胞因子间的相互作用,以及各亚基在细胞中错综复杂的定位情况,都揭示了植物Exocyst复合体亚基家族神秘的功能。而目前在甜瓜中相关基因的功能分析未见报道,因此本研究对甜瓜Exocyst家族基因进行鉴定、克隆,分析了其功能与表达模式,主要结果如下:
(1)应用生物信息学方法,在甜瓜基因组数据库中搜索并鉴定出了30个甜瓜Exocyst复合体亚基成员(18个EXO70、3个EXO84和9个SEC基因),完成了其中23个基因的克隆与鉴定。蛋白保守结构域分析表明,甜瓜EXO70亚基家族的18个成员均含有EXO70结构域;EXO84亚基家族成员中的EXO84A和EXO84B含有Vps51结构域;SEC亚基家族中的SEC3亚基含有PIP2-binding结构域。基因结构分析表明,家族中大多数EXO70基因均无内含子。
(2)实时荧光定量PCR分析表明甜瓜幼苗在植物激素MeJA、SA、ACC、ABA的诱导下,甜瓜Exocyst家族基因的表达模式存在较大差异。在受到MeJA诱导后,上调表达的基因占大部分,其中EXO70H4、SEC3、SEC15A、SEC15C极显著上调表达;而在SA诱导下,大多数基因表达量总体下调;其中EXO70H1、EXO70H3极显著下调表达;然而,SEC5的基因表达无明显变化;经MeJA和SA处理后表达量都总体上调的基因是EXO70A1;表达量都总体下调的基因是SEC15D。在ACC和ABA诱导过程中,多数基因表达量有所下降。甜瓜蔓枯病菌侵染后三种信号途径的相关基因都上调表达,在接种第3d表达量增加得最为显著;EXO70H1、EXO70H2、SEC5、SEC15A四个基因在甜瓜遭受蔓枯病菌侵染后表达量显著升高;EXO70A1、EXO70A2这两个基因表达量出现显著下调。
(3)在蔓枯菌培养板中,小分子ES2(Endosidin2)工作浓度达到100μM时,与对照组相比,两种菌株的菌落直径显著缩小;YY蔓枯菌的菌落直径为对照组的0.46倍;DQ蔓枯菌的菌落直径为对照组的0.37倍。孢子悬浮液中加入工作浓度100μM的ES2,接种后病斑面积显著小于对照组。以上结果说明,小分子ES2很可能通过靶标蔓枯病菌Exocyst复合体从而影响了蔓枯菌的生长和侵染力。
(4)蛋白亚细胞定位结果表明:甜瓜Exocyst家族蛋白的亚细胞定位情况不尽相同。其中,EXO70A1亚基主要定位于细胞膜上,仅有少量的核定位;EXO70B、EXO70C1、SEC8亚基仅定位于细胞膜上;EXO70C2、EXO70E1、EXO70E2、EXO70F1、SEC15D在细胞中散状分布;EXO70A2、EXO70D、SEC3、SEC15A、SEC15C、EXO70H2在细胞中点状分布;此外,EXO70F2无明显的核膜定位现象,在细胞中呈现散状和点状分布。
(5)利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术两种方法明确了甜瓜Exocyst家族EXO70亚基与SEC亚基之间存在11组互作关系。
(6)构建甜瓜Exocyst家族基因的过量表达载体,获得了转13个甜瓜Exocyst复合体亚基基因且能稳定遗传的拟南芥纯合体株系。在拟南芥中研究了Exocyst家族的上述13个基因异源表达后对其长势影响以及在植株抗逆过程中发挥的作用。对转基因拟南芥活体喷雾和离体叶片接种灰霉病菌(Botrytis cinerea)结果表明,与野生型拟南芥col-0相比,过表达CmEXO70B、CmEXO70H1、CmSEC3、CmSEC15C基因拟南芥植株增强了对B.cinerea的抗性,而过表达CmEXO70H3基因拟南芥植株降低了对B.cinerea的抗性。表明在植株与灰霉菌互作的过程中CmEXO70B、CmEXO70H1、CmSEC3、CmSEC15C可能起到了正调控作用;而CmEXO70H3起到了负调控作用。接种PstDC3000后,与野生型拟南芥col-0相比,过表达CmEXO70B、CmEXO70H1基因拟南芥植株增强了对Pst DC3000的抗性;而过表达CmEXO70A1、CmEXO70H3和CmSEC3基因拟南芥植株削弱了对Pst DC3000的抗性。表明在植株与Pst DC3000互作的过程中CmEXO70B、CmEXO70H1可能起到了正调控作用;而CmEXO70A1、CmEXO70H3和CmSEC3起到了负调控作用。在种子萌发阶段,与野生型相比,CmEXO70H1、CmEXO70H4和CmSEC3基因在拟南芥中过表达能提高种子对ABA胁迫的耐受性;CmSEC5和CmSEC15A基因在拟南芥中过表达显著削弱种子对ABA胁迫的耐受性。
(1)应用生物信息学方法,在甜瓜基因组数据库中搜索并鉴定出了30个甜瓜Exocyst复合体亚基成员(18个EXO70、3个EXO84和9个SEC基因),完成了其中23个基因的克隆与鉴定。蛋白保守结构域分析表明,甜瓜EXO70亚基家族的18个成员均含有EXO70结构域;EXO84亚基家族成员中的EXO84A和EXO84B含有Vps51结构域;SEC亚基家族中的SEC3亚基含有PIP2-binding结构域。基因结构分析表明,家族中大多数EXO70基因均无内含子。
(2)实时荧光定量PCR分析表明甜瓜幼苗在植物激素MeJA、SA、ACC、ABA的诱导下,甜瓜Exocyst家族基因的表达模式存在较大差异。在受到MeJA诱导后,上调表达的基因占大部分,其中EXO70H4、SEC3、SEC15A、SEC15C极显著上调表达;而在SA诱导下,大多数基因表达量总体下调;其中EXO70H1、EXO70H3极显著下调表达;然而,SEC5的基因表达无明显变化;经MeJA和SA处理后表达量都总体上调的基因是EXO70A1;表达量都总体下调的基因是SEC15D。在ACC和ABA诱导过程中,多数基因表达量有所下降。甜瓜蔓枯病菌侵染后三种信号途径的相关基因都上调表达,在接种第3d表达量增加得最为显著;EXO70H1、EXO70H2、SEC5、SEC15A四个基因在甜瓜遭受蔓枯病菌侵染后表达量显著升高;EXO70A1、EXO70A2这两个基因表达量出现显著下调。
(3)在蔓枯菌培养板中,小分子ES2(Endosidin2)工作浓度达到100μM时,与对照组相比,两种菌株的菌落直径显著缩小;YY蔓枯菌的菌落直径为对照组的0.46倍;DQ蔓枯菌的菌落直径为对照组的0.37倍。孢子悬浮液中加入工作浓度100μM的ES2,接种后病斑面积显著小于对照组。以上结果说明,小分子ES2很可能通过靶标蔓枯病菌Exocyst复合体从而影响了蔓枯菌的生长和侵染力。
(4)蛋白亚细胞定位结果表明:甜瓜Exocyst家族蛋白的亚细胞定位情况不尽相同。其中,EXO70A1亚基主要定位于细胞膜上,仅有少量的核定位;EXO70B、EXO70C1、SEC8亚基仅定位于细胞膜上;EXO70C2、EXO70E1、EXO70E2、EXO70F1、SEC15D在细胞中散状分布;EXO70A2、EXO70D、SEC3、SEC15A、SEC15C、EXO70H2在细胞中点状分布;此外,EXO70F2无明显的核膜定位现象,在细胞中呈现散状和点状分布。
(5)利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术两种方法明确了甜瓜Exocyst家族EXO70亚基与SEC亚基之间存在11组互作关系。
(6)构建甜瓜Exocyst家族基因的过量表达载体,获得了转13个甜瓜Exocyst复合体亚基基因且能稳定遗传的拟南芥纯合体株系。在拟南芥中研究了Exocyst家族的上述13个基因异源表达后对其长势影响以及在植株抗逆过程中发挥的作用。对转基因拟南芥活体喷雾和离体叶片接种灰霉病菌(Botrytis cinerea)结果表明,与野生型拟南芥col-0相比,过表达CmEXO70B、CmEXO70H1、CmSEC3、CmSEC15C基因拟南芥植株增强了对B.cinerea的抗性,而过表达CmEXO70H3基因拟南芥植株降低了对B.cinerea的抗性。表明在植株与灰霉菌互作的过程中CmEXO70B、CmEXO70H1、CmSEC3、CmSEC15C可能起到了正调控作用;而CmEXO70H3起到了负调控作用。接种PstDC3000后,与野生型拟南芥col-0相比,过表达CmEXO70B、CmEXO70H1基因拟南芥植株增强了对Pst DC3000的抗性;而过表达CmEXO70A1、CmEXO70H3和CmSEC3基因拟南芥植株削弱了对Pst DC3000的抗性。表明在植株与Pst DC3000互作的过程中CmEXO70B、CmEXO70H1可能起到了正调控作用;而CmEXO70A1、CmEXO70H3和CmSEC3起到了负调控作用。在种子萌发阶段,与野生型相比,CmEXO70H1、CmEXO70H4和CmSEC3基因在拟南芥中过表达能提高种子对ABA胁迫的耐受性;CmSEC5和CmSEC15A基因在拟南芥中过表达显著削弱种子对ABA胁迫的耐受性。