胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族包括GDNF、NRTN(neurturin)、ARTN (artemin)、PSPN(persephin)四个成员。它们不仅可以支持中枢神经系统内中脑多巴胺能神经元与运动神经元等多种神经元的存活和发育，还支持许多外周神经元如交感、副交感、感觉与肠道神经元等的存活并调节其分化。除神经系统外，GDNF还是肾脏发育中的重要的形态形成因子，并在精原细胞分化过程中起关键的调节作用。GDNF家族成员通过其相应受体介导信号转导引起一系列细胞效应，即在GFRα1-4的帮助下与受体RET结合，促进RET二聚化和自磷酸化，继而由RET进一步结合和激活下游信号分子，发生一系列信号级联反应，最终激活Ras／MAPK、PI3-K以及PLCγ等信号转导通路。RET受体属于受体酪氨酸激酶(RTK，Receptor Tyrosine Kinase)家族成员，是一种跨膜糖蛋白，含胞外域、跨膜段和胞内域三个部分。其中胞内域含酪氨酸激酶活性区和重要的酪氨酸结合位点，如Y1062可以至少和5种入坞蛋白结合：She、FRS2、DOK4／5、IRS1／2和enigma，从而激活MAPK或PI-3K等途径，促进神经元存活及轴突生长或分支。 SH2-B根据C端长短差异分为α、β和γ三种剪切体，是一种非常重要的接头蛋白，与APS、Lnk共同组成一类接头蛋白新家族。SH2-B含有多个可参与蛋白与蛋白之间相互作用的基序，如SH2结构域、PH结构域、多个富含脯氨酸的区域以及许多潜在的磷酸化位点。SH2-B通过SH2区域可与／rkA、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、血小板源性生长因子受体、成纤维生长因子受体、肝细胞生长因子受体、非受体类酪氨酸激酶JAK2、IgE的FcεRI受体等结合。 我们在前期研究中，用RET胞内域为诱饵经酵母双杂交筛选人脑cDNA文库，初步证实RET与SH2-Bβ在体外存在结合(张勇博士论文，2002)。本研究拟通过分子生物学及细胞生物学等技术手段，进一步确证GDNF受体RET与信号分子SH2-Bβ在体外与体内是否均能发生结合，明确介导此结合的结构域或结合位点，探寻此结合的功能及生理意义。 本研究的主要结果如下：第二军医大学硕士学位论文 1、用PCR方法扩增大鼠SHZ一B日全长、PH结构域和SHZ结构域，用PCR QuiekMutagensiS方法制备SHZ一Bp突变体R555E，并将以上各基因分别克隆入酵母AD载体，通过酵母双杂交方法分别与RET胞内域的诱饵蛋白在酵母中进行体外结合检测。结果表明，单独的PH结构域不与RET结合，而单独的SHZ结构域就可以和RET结合，且这种结合会随SHZ结构域功能的破坏而消失。表明SHZ结构域是SHZ一B目和RET结合的充分且必要条件，而PH结构域并不能与RET结合。 2、用免疫共沉淀的方法证实，仅在GDNF刺激后的PC 12一rGFR叭一RET稳定细胞株中，内源性的SHZ一Bp与RET可发生结合;而在刺激后的野生型PC12细胞中，内源性的SHZ一Bp与RET不发生结合。提示SHZ一Bp和RET在细胞内的结合，依赖于GDNF受体的激活。 3、用免疫共沉淀的方法显示，在脊髓和中脑的组织裂解液中，内源性的SHZ一B日与RET能发生结合。证明SHZ一BB与RET在体内一些组织内不但有共存，且存在生理上的结合。 4、用EGFP一NZ质粒分别和野生型SHZ一B旦或者其突变体R555E瞬时共转染己构建的PC12一rGFRal~RET稳定细胞株，通过荧光显微镜形态进行观察和数量统计。结果表明，仅在GDNF刺激后SHZ一Bp组发生突起生长的细胞分化比例明显高于对照组，而R555E组细胞分化比例则明显低于对照组。提示SHZBp可能参与了GDNF引起的PC12细胞分化的信号转导通路。 5、用EGFP一NZ质粒分别和野生型SHZ一Bp或者其突变体R555E瞬时共转染原代培养7DIV大鼠中脑神经元，瞬时转染含有GFP的野生型SHZ一Bp或者其突变体R555E，通过荧光显微镜进行形态观察和数量统计。结果表明，GDNF刺激后SHZ一Bp组中脑神经元突起较对照组长，而R555E组神经元突起较对照组和SHZ一Bp组短，且均具显著性差异。提示SHZBp可能在GDNF促中脑神经元突起生长的信号转导中起作用。 综上所述，本课题在前期酵母双杂交证实SHZ一Bp与RET体外结合的基础上，进一步明确SHZ结构域是介导SHZ一Bp与RET体外结合的必需功能域。通过免疫共沉淀和荧光形态观察，发现SHZ一Bp与RET在体内亦存在结合，且这种结合对于细胞和神经元的突起生长有功能性影响。以上研究结果均未见文献报道。