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研究背景:肠道缺血再灌注损伤是一种常见的病理生理过程,许多疾病的病程中都会不同程度地伴随缺血再灌注损伤,如肠系膜动脉栓塞、绞窄疝、充血性心力衰竭、严重创伤、失血性休克等,一些手术及临床操作也可能导致缺血再灌注损伤,如大血管手术、小肠移植、心肺流转术及血液透析等。急性肠缺血严重时可威胁到患者生命导致死亡,其死亡率约为60-8 0%,近年来肠缺血的发生呈不断增加的趋势,因此深入了解肠道缺血再灌注损伤的发生机制,有助于减轻缺血再灌注损伤。肠道缺血再灌注损伤的发生机制目前不甚清楚,相关学者先后提出氧自由基损伤、白细胞黏附与血管内皮细胞损伤、炎症介质与细胞因子和细胞凋亡等一系列学说,而这些学说与缺血再灌注时N F-κB信号的激活从而导致各种损害因子的出现有着重要的联系,N F-κB是参与炎症基因(如黏附分子、细胞因子、酶等)表达、细胞凋亡、细胞增殖与分化、氧化应激反应等诸多生物过程的一种重要的核转录调节因子。肠黏膜屏障功能的损害包括缺血再灌注时各种炎症介质的释放所导致的肠黏膜上皮通透性增加,还包括缺血再灌注时肠上皮细胞间的紧密连接蛋白等物理屏障损害导致的细胞间隙增加,从而造成细菌及肠道的有害物质进入到血液中引起严重的全身炎症反应。本文就是围绕缺血再灌注时N F-κB信号激活及紧密连接蛋白破坏这一问题而展开研究的。方法:1.制作肠上皮细胞缺氧模型及大鼠肠缺血再灌注损伤模型,肠上皮细胞置于培养箱内缺氧培养6小时后(1%O2,5%CO 2),加入裂解液提取蛋白。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后,常规脱毛备皮后,取腹部正中切口,沿腹白线剪开腹膜,用血管夹夹闭肠系膜上动脉20分钟,松开血管夹恢复血管灌注1小时后处死大鼠,取上段空肠制作切片。We st e r n-bo lt、免疫荧光检测肠上皮细胞内的B MP信号通路的表达变化。2.肠上皮细胞I E C-6接种至培养板内,加入外源性B MP 2、B MP4蛋白刺激细胞,同时加入B MP信号通路特异性性拮抗剂no g g i n蛋白,并且大鼠腹腔内注射no gg in蛋白预处理3 0分钟后再接受缺血再灌注损伤,S ha m组及缺血再灌注组作为对照,We st er n-bo lt、免疫荧光检测肠上皮细胞内N F-κB信号通路的表达变化。3.RT-P CR检测肠上皮细胞外源性BM P2、B MP4及no gg in蛋白刺激后,细胞内TN F-a、I L-6等炎症基因的表达变化水平。4.West er n-bo lt检测外源性B MP2、B M P 4对肠上皮细胞I E C-6内AKT信号及紧密连接蛋白o c c lu d in表达变化的影响。结果:1.肠上皮细胞缺氧培养6小时后,细胞内的BMP 2、B MP 4与对照组比较表达增加,受体B MP RIa、BMP RII表达上调,同时免疫荧光实验观察到,肠绒毛内的BMP 2、BMP 4、B MP RI a、B MP RI I荧光信号在缺血再灌注后较S ha m组明显增强。2.外源性的B MP 2、BMP4可直接激活肠上皮细胞内的N F-κB信号,免疫荧光实验观察到N F-κB发生磷酸化后转移至核内参与调控,而B MP信号通路的特异性拮抗剂no gg in蛋白可部分逆转N F-κB向核内转移。动物模型内缺血再灌注组肠上皮细胞内N F-κB信号明显激活,而予no gg in蛋白预处理30分钟组的大鼠N F-κB信号激活水平降低。3.外源性B MP2、B MP 4可诱导I E C-6细胞内的T NF-a、I L-6的表达,导致炎症介质的释放,no g g in蛋白可减少T N F-a、I L-6的产生。4.AKT信号在加入B MP 2、B MP4刺激3 0分钟时磷酸化水平明显增加,细胞间紧密连接蛋白o c c lu d in在加入BM P 2、B MP 4培养2 4小时后,蛋白表达水平明显降低,BMP信号的特异性拮抗剂no g g in蛋白及N F-κB通路的阻断剂P DT C都可阻止o cc lu d in蛋白的减少。结论:1.缺氧及缺氧再灌注条件下,肠上皮细胞内的B MP 2、B M P4蛋白表达增加,受体BMP RI a、B MP RII表达上调。在小肠绒毛组织内,BMP 2及B MP4在绒毛顶端增加最明显,而基底及隐窝处增加较弱。2.BMP2及B MP 4可激活肠上皮细胞内的N F-κB信号,导致炎症介质T N F-a、I L-6释放,增加肠黏膜屏障的通透性。3.B MP 2及BMP 4激活肠上皮细胞内AKT信号减少紧密连接蛋白o c c lud in的表达,损害肠黏膜物理屏障的完整性。