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目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素，其污染非常普遍，在粮食作物和食品中存在非常广泛。OTA的主要毒性作用器官是肾脏，OTA可能是巴尔干地方性肾病的主要致病原，1993年国际癌症研究中心IARC将OTA列为“可能的人类致癌物”。除外肾毒性，动物实验研究还发现OTA具有免疫毒性、肝毒性、神经毒性、致突变性、致畸性和致癌性等生物效应。长期食用OTA污染的饲料，可以诱发F344/N大鼠出现前胃上皮细胞增生和乳腺纤维腺瘤。由于在食物中分布的广泛性，人类很容易长期暴露于OTA的毒性环境中。研究表明一些真菌毒素的早期毒性作用是通过引起凋亡、增殖抑制或者周期阻滞，比如脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮及烟曲霉毒素B1。我们实验室前期研究工作发现，OTA通过下调人胃黏膜上皮细胞周期调控关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达引起细胞G2期阻滞，提示OTA可通过G2期阻滞来发挥其部分毒性作用，在中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）及非洲绿猴肾脏细胞（CV-1）中，OTA也通过导致G2期阻滞来发挥其毒性作用。丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联是细胞内重要的信号转导系统之一，参与细胞的各种生理及病理活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。MAPKs家族最主要的成员为ERK（细胞外信号调节激酶）通路，JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶）通路和p38MAPK通路。研究表明在各种刺激因素的作用下，细胞可以通过激活或抑制MAPK信号通路而启动细胞G2期检测点，使细胞发生G2期阻滞。Yang等人发现脱氧雪腐镰刀菌烯醇介导的G2/M阻滞是通过ERK1/2信号通路增强p21水平实现的。然而，目前有关OTA诱导人胃黏膜上皮细胞G2阻滞的相关分子机制尚不明了。鉴于MAPK信号通路在细胞周期中的重要作用，我们提出这样的假设，即MAPK信号通路可能参与OTA诱导的人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞。为验证本假设，本实验将观察JNK、ERK和p38MAPK信号通路在OTA诱导的G2期阻滞中的作用，以期揭示OTA诱导体外人胃黏膜上皮细胞G2期阻滞的可能分子机制。方法：1细胞培养与处理正常人胃黏膜上皮细胞（GES-1）培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中，37℃、5%CO2培养，细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予OTA，使其终浓度分别为5、10、20μM，溶剂对照组给予终浓度为0.08%的甲醇（每组设平行样本3个），继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。2阻断剂处理对数生长期GES-1细胞，分别给予10μM SB203580(p38的阻断剂或者10μM PD98059（ERK的阻断剂）预处理30min。实验分为4组，即溶剂对照组、阻断剂组、OTA处理组和阻断剂+OTA处理组。细胞处理24h后收集细胞检测相关指标。3siRNA转染分别用100pmol ERK和p38特异性siRNA转染细胞，再加入20μMOTA继续培养24h收集细胞进行相关指标检测。同时转染Negtive controlsiRNA（NC siRNA）作为阴性对照。检测ERK和p38基因被干扰后对OTA诱导的G2期阻滞的影响。4流式细胞术检测细胞周期（FCM）OTA作用24h后，分别收集各组细胞，PBS洗涤，离心收集细胞，用70%冰乙醇固定检测细胞周期分布情况。5蛋白免疫印迹（Western blot）OTA处理GES-1细胞24h后，提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法，检测OTA处理后人胃黏膜上皮细胞GES-1中JNK/磷酸化型JNK、ERK/磷酸化型ERK和p38/磷酸化型p38以及G2期调控蛋白的表达情况。6免疫共沉淀（IP）提取细胞总蛋白，120μg各组蛋白加入1μg CyclinB1抗体4℃摇床过夜，进行琼脂糖凝胶电泳检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况7统计采用SPSS13.0软件进行相关分析与单因素方差分析（analysis ofvariance, ANOVA），数据用x±s表示，检验以P<0.05为差异有显著性意义。结果：1OTA对体外培养GES-1细胞JNK、ERK和p38信号通路的影响1.1OTA使GES-1细胞内的ERK和p38磷酸化水平升高，对JNK无影响Western blot结果显示，OTA5、10和20μM处理24h后，p38和ERK磷酸化水平明显高于溶剂对照组（P<0.05），而JNK磷酸化蛋白相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P>0.05）。同时，各OTA处理组细胞内非磷酸化p38、ERK和JNK蛋白水平均未发生明显变化（P>0.05）。1.2ERK和p38阻断剂可对抗OTA引起的ERK和p38磷酸化水平的升高结果显示，与OTA20μM处理组相比，ERK的磷酸化水平在PD98059+OTA组明显降低（P<0.05）。同样的，SB203580预处理也逆转了OTA引起的p38磷酸化水平的升高（P<0.05）。以上结果表明，OTA处理可以激活GES-1细胞内的p38和ERK信号通路，而对JNK通路并未造成影响。2阻断ERK信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响2.1ERK特异性阻断剂（PD98059）预处理对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM结果显示，PD98059预处理+OTA20μM组G0/G1期细胞比例较20μM OTA单独处理组明显增加，G2/M期细胞比例则显著降低（P<0.05）。表明PD98059可以部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。2.2ERK siRNA干扰对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM研究结果发现，NC siRNA处理组与溶剂对照组细胞周期分布无明显差异（P>0.05）。ERK siRNA转染则可以显著逆转OTA对GES-1细胞周期的影响，即显著了升高G0/G1期细胞比例，降低了G2/M期细胞的比例（P<0.05）。表明ERK siRNA转染可部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。上述结果表明ERK信号通路参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。3阻断p38信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响3.1p38特异性阻断剂（SB203580）预处理对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM结果发现，SB203580预处理对细胞周期的影响类似于PD98059，即与OTA20μM处理组相比，SB203580预处理降低了GES-1细胞的G2/M期细胞比例（P<0.05）。表明SB203580可以部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。3.2p38siRNA干扰对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM研究结果发现，NC siRNA处理组细胞周期分布与溶剂对照组相比无明显差异（P>0.05）。而p38siRNA转染则显著逆转了OTA导致的G2期阻滞（P<0.05）。以上结果证明p38信号通路参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。4阻断ERK信号通路对OTA诱导的GES-1细胞G2期调控蛋白的影响4.1ERK特异性阻断剂（PD98059）预处理对GES-1细胞G2期调控蛋白的影响Western blot结果显示，与20μM OTA处理组相比，PD98059预处理+OTA20μM组G2期相关蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）及磷酸化形式的Cdc25C和Cdc2的表达明显增加（P<0.05）。IP结果显示，PD98059预处理GES-1细胞同时增加了Cdc2-CyclinB1复合物的形成（P<0.05）。表明PD98059预处理可逆转OTA对GES-1细胞G2期调控蛋白表达降低的影响。4.2ERK siRNA干扰对GES-1细胞G2期调控蛋白的影响Western blot检测结果显示，ERK siRNA转染可对抗OTA引起的Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白表达的下降（P<0.05）。NC siRNA处理组细胞内上述蛋白的相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P>0.05）。IP结果显示，NC siRNA处理组细胞内Cdc2-CyclinB1复合物与溶剂对照组相比没有明显差别（P>0.05），而与OTA20μM处理组相比，ERKsiRNA+OTA20μM处理组Cdc2-CyclinB1复合物明显增多（P<0.05）。以上结果提示，ERK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的p38-1细胞G2期阻滞。5阻断p38信号通路对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响5.1p38特异性阻断剂（SB203580）预处理对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响Western blot结果显示，SB203580预处理+OTA20μM组与20μMOTA处理组相比，Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白的表达明显增加（P<0.05）。另外，IP结果显示，与OTA20μM处理组相比，SB203580预处理+OTA20μM处理组Cdc2-CyclinB1复合物明显增多（P<0.05）。5.2p38siRNA干扰对p38-1细胞G2期调控蛋白的影响Western blot检测结果显示，NC siRNA处理组细胞内Cdc2/磷酸化型Cdc2、Cdc25C/磷酸化型Cdc25C和CyclinB1蛋白相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性（P>0.05）。而p38siRNA转染后可以对抗OTA引起的上述蛋白的下降（P<0.05）。IP结果显示，Cdc2-CyclinB1复合物在NC siRNA处理组与溶剂对照组相比没有明显差别（P>0.05），而p38siRNA转染显著逆转了OTA20μM引起的Cdc2-CyclinB1复合物的降低（P<0.05）。以上结果提示，p38MAPK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的p38-1细胞G2期阻滞。结论：1赭曲霉毒素A作用于p38-1细胞24h，可以激活ERK和p38MAPK信号转导通路，对JNK信号通路并未造成影响。2阻断ERK和p38MAPK信号通路可对抗赭曲霉毒素A对p38-1细胞的G2期阻滞作用。3阻断ERK和p38MAPK信号通路可对抗赭曲霉毒素A对G2期调控关键蛋白（Cdc2/p-Cdc2、Cdc25C/p-Cdc25C、CyclinB1）和Cdc2-CyclinB1复合物的降低作用。4ERK和p38MAPK信号通路通过调控G2期调控蛋白（Cdc25C、Cdc和CyclinB1）的表达参与OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。