目的:残黄片是由黄连、青黛、白矾、郁金4味药组成的中药复方制剂,是解放军总医院第五医学中心用于治疗慢性肝炎伴随的黄疸持久不退——残留黄疸的临床专用药,拥有四十余年的应用历史,退黄作用确切。目前,对该方退黄作用机制尚不明确,且方中青黛和白矾比重悬殊,在制备过程中对药粉的均匀性和成型片剂的质量尚有影响。本研究以解决该品存在的制剂问题和探索其退黄作用机制为目的,为保障该品质量并进一步开发利用提供依据。方法:（1）残黄片制备工艺的优化:筛选方中单药的最佳超微粉碎工艺,依据结果结合中药复合粒子制备方法设计3种残黄片超微粉碎工艺并根据粉碎时间和粒径分布关系进行优化筛选,确定3种工艺的最佳制备条件。进而考察3个粉碎工艺制备的药粉粒径分布、比表面积、松密度、振密度和休止角,并进行电镜扫描形态分析和差示量热法考察粉体热稳定性,综合对比3种工艺药粉的特性。在此基础上制备不同粉碎工艺残黄片和原粉碎工艺残黄片各3个批次,考察不同工艺下的残黄片成型中间体的得率,并对成品进行高温、高湿和强光影响因素试验,考察片剂的外观、片重差、崩解时限、脆碎度和小檗碱含量,评价不同粉碎工艺对残黄片质量稳定性的提升贡献,筛选出残黄片最佳粉碎工艺。（2）基于分子对接技术的残黄片退黄作用机制研究:首先从TCMSP数据库（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）中搜集方中黄连、青黛、郁金的成分,设定口服吸收利用度≥30%、相对分子质量≤500、氢键供体数目≤5、氢键受体数目≤10、脂水分配系数不大于5为条件筛选类药成分,Discovery Studio 2016（DS 2016）软件对每个类药成分进行加氢,赋予CHARMm力场,定义为分子对接配体。黄疸治疗相关靶点从CTD数据库（http://ctdbase.org/）以“jaundice”、“cholestatic liver disease”为关键词获取黄疸相关基因,并输入到Drug-Bank数据库（https://www.drugbank.ca/）中查询已上市药物的作用靶点及其PDB ID,再从PDB数据库（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中以ID下载治疗黄疸相关靶蛋白,DS 2016软件删去原配体以及水分子,去多构象,补充氨基酸残基,加氢,定义为分子对接受体。运用DS 2016软件LibDock模块设定对接参数,max hits to save为200、max number of hits为1000、minimum LibDock score为105、conformation method为FAST,将定义的配体成分与受体一一对接评价,结果以LibDock score打分函数给出。对LibDock score大于105的成分-靶点名称进行规范化,将成分-靶点数据对导入Gephi 0.9.2软件,Fruchterman-Reingold布局,刻画成分-靶点作用网络,经其数据统计模块分析网络的密度、介数和平均路径,评价其稳定性,明确对网络稳定性有重要贡献的残黄片成分和靶点,并以靶点功能分类阐述残黄片退黄作用机制。（3）残黄片对ANIT诱导黄疸模型大鼠的退黄作用机制研究:正常组以10 mL·kg^-1·d^-1灌胃生理盐水连续7天,大豆油10 mL·kg^-1灌胃模拟造模。模型组以10 mL·kg^-1·d^-1灌胃生理盐水连续7天,α-萘异硫氰酸酯（ANIT）75 mg·kg^-1的大豆油溶液灌胃造模。残黄片（CHP）组以0.315 g·kg^-1·d^-1剂量灌胃工艺优化残黄片连续7天,ANIT以75 mg·kg^-1的大豆油溶液灌胃造模。残黄片高剂量（CHP高）组以0.710 g·kg^-1·d^-1剂量灌胃工艺优化残黄片连续7天,ANIT以75 mg·kg^-1的大豆油溶液灌胃造模。原残黄片（原CHP）组以0.315 g·kg^-1·d^-1剂量灌胃原工艺残黄片连续7天,ANIT以75 mg·kg^-1的大豆油溶液灌胃造模。熊去氧胆酸（UDCA）组以0.135 g·kg^-1·d^-1剂量灌胃熊去氧胆酸片连续7天,ANIT以75 mg·kg^-1的大豆油溶液灌胃造模。各组大鼠于第5 d给药2 h后,模型组、CHP组、UDCA组灌胃ANIT复制黄疸模型,正常组灌胃等体积大豆油模拟造模,于第7 d给药2 h后腹腔注射20%乌来糖(20 mL·kg^-1)溶液麻醉,腹主动脉采血,采集肝和回肠组织。工艺优化前后残黄片退黄保肝作用的比较:通过检测血清总胆红素（TBIL）、总胆汁酸（TBA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平,比较工艺优化残黄片和原粉碎工艺残黄片的退黄保肝作用,确定机制研究组别。并进行HE染色观察大鼠肝组织病变情况。胆汁肝肠循环角度开展退黄机制研究:RT-PCR检测肝组织法尼醇X受体（FXR）、孕烷X受体（PXR）、组成性雄烷受体（CAR）、胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）、葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）、胆汁酸盐外排蛋白（BSEP）、多耐药相关蛋白2（MRP2）、Na⁺-牛磺胆酸共转运体（NTCP）、有机阴离子转运多肽1A1（OATP1A1）和回肠组织FXR、顶端Na⁺-胆汁酸协同转运体（ASBT）、回肠胆汁酸结合蛋白（IBABP）、MRP2蛋白的mRNA表达水平。Western blot检测肝组织FXR、CYP7A1、UGT1A1、BSEP、MRP2、NTCP、OATP1A1和回肠组织FXR、IBABP、MRP2蛋白的表达水平。结果:（1）筛选确定了残黄片组方单药的最佳超微粉碎时间:黄连25 min、青黛10 min、白矾5 min、郁金25 min。工艺1最佳粉碎条件为4味药按比例混合后超微粉碎20 min。黄连郁金粉碎复合最佳时间为25 min,青黛白矾粉碎复合最佳时间为10 min,即工艺2最佳粉碎条件为黄连郁金粉碎复合25 min,青黛白矾粉碎复合10 min,再将二者混匀。工艺3粉碎条件为黄连郁金粉碎复合25min,加入青黛粉碎复合10 min,最后加入白矾粉碎复合5 min。3种粉碎工艺制备的粉体特性各有差异,粉体电镜扫描形态分析上工艺1粉体未见复合粒子结构,分散不均匀,粉体颗粒的大小差异较大。工艺2粉体偶见复合粒子结构,但分散不均匀,局部有分层。工艺3粉体全视野可见结构规整的蜂窝状复合粒子结构,粉体分散均匀。粉体热稳定性方面工艺1比热容为262.1 J·g^-1,工艺2比热容为242.7 J·g^-1,工艺3比热容为295.9 J·g^-1,热稳定性工艺3最佳。3种超微粉碎工艺对成型中间体的得率均有提升,高温、高湿、强光影响因素下工艺2和工艺3片各项检测合格,提升了残黄片质量稳定性。（2）通过残黄片成分的类药性筛选共得到了174个成分,其中黄连25个,成分类型主要有异喹啉类生物碱、有机酸和木脂素类;青黛14个,主要为吲哚类生物碱;郁金135个,主要由倍半萜类和二苯基庚烃（姜黄素）类成分组成。搜集得到治疗黄疸相关靶点共32个,分子对接筛选出作用靶点14个,潜在活性成分共37个。成分-靶点作用网络分析得出穆坪马兜铃酰胺、corchoroside A、槲皮素、去甲氧基姜黄素、小檗浸碱、桤木酮、黄柏酮、氢化小檗碱、姜黄素、柚皮素共10个成分与单胺氧化酶A、前列腺素合酶2、内皮型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶、细胞色素P450 2E1、GTP环化水解酶1、法尼醇X受体等7个以上靶点作用,对成分-靶点网络稳定性具有重要贡献,可能通过调节胆红素代谢、调控胆汁酸合成转运、抑制免疫与炎症反应、影响肝脏胶原形成等途径发挥退黄作用。（3）退黄保肝作用比较结果显示,模型组大鼠血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP含量显著高于正常组（P<0.01）,表明黄疸模型复制成功。对比模型组,CHP组、原CHP组和UDCA组血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP水平均有显著降低（P<0.01或P<0.05）,表明残黄片中剂量(0.315 g·kg^-1·d^-1)的退黄作用明显。而CHP高剂量组TBIL、TBA水平高于模型组,有加重黄疸的风险。工艺优化残黄片以0.315 g·kg^-1·d^-1的剂量干预对降低血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP水平的作用优于UDCA（P<0.01）和原CHP,提示残黄片工艺优化后促进了退黄保肝作用,且中剂量作用优于高剂量。HE染色结果显示正常组大鼠肝组织以小叶间静脉为中心,规整排列,肝细胞间紧密连接,细胞结构清晰完整,细胞核大而圆,未见坏死或炎性细胞浸润。模型组大鼠肝组织病变明显,肝细胞排列疏松紊乱,多数肝细胞核萎缩且有空泡产生,细胞间紧密连接被破坏。CHP组肝脏病变不明显,肝细胞排列规整,紧密连接破坏较小,多数细胞核大而圆,少见空泡样变性。RT-PCR和western blot检测结果显示,与模型组比较CHP能激活大鼠肝组织FXR的mRNA和蛋白的表达升高,显著降低胆汁酸合成限速酶CYP7A1的mRNA转录和翻译（P<0.01）,抑制胆汁酸合成;促进PXR和UGT1A1的mRNA表达,显著提高胆红素代谢酶UGT1A1的表达（P<0.01）,促进肝内胆红素的亲水解毒和易于转运出肝脏。残黄片对肝内胆汁成分的外排蛋白BSEP、MRP2的mRNA和蛋白的表达均有显著提高作用（P<0.01）,促进胆汁酸和胆红素排出肝脏,缓解肝内胆汁淤积;并能明显抑制胆汁肝脏摄取相关OATP1A1的表达（P<0.01）,减轻肝内胆汁淤积情况。与模型组比较CHP能提升肝脏NTCP的mRNA和蛋白的表达。在回肠,与模型组比较CHP和UDCA均能显著提高FXR的mRNA转录和蛋白的表达（P<0.01）,明显抑制ASBT mRNA的转录,并显著提高MRP2的mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,抑制胆汁酸的肠吸收并促进胆红素等的肠道排出。与模型组比较CHP还能促进IBABP的mRNA和蛋白的表达使其趋于正常水平。结论:（1）采用复合粒子制备方法优化残黄片粉碎工艺,使其粉体形成结构规整、分散均匀、热稳定性好的复合粒子,解决了青黛白矾混合不均匀和裂片、碎片的问题,并提高了制剂中间体得率,提升了残黄片质量稳定性。（2）通过分子对接筛选出残黄片退黄潜在活性成分37个,作用靶点14个,分析得出其退黄机制可能与调节胆红素代谢、调控胆汁酸合成转运、抑制免疫与炎症反应、影响肝脏胶原形成等作用有关。（3）残黄片对胆汁的肝肠循环有调节作用,工艺优化残黄片以0.315 g·kg^-1·d^-1的中剂量干预黄疸模型大鼠,退黄保肝作用优于其高剂量干预和原粉碎工艺残黄片的治疗作用,表明残黄片制备工艺的优化提升了其退黄保肝作用,且提示高剂量给药有加重黄疸的风险。该品能提高黄疸模型大鼠肝脏FXR的表达,显著抑制CYP7A1的mRNA转录和翻译,减少胆汁酸的合成,缓解胆汁淤积。残黄片还能明显抑制OATP1A1的mRNA转录和蛋白表达,减少胆红素和部分胆汁酸的肝脏摄取,缓解肝内胆汁淤积。同时,残黄片还提高了肝脏BSEP和MRP2的表达,促进了肝内胆汁酸、胆红素的排出,降低了淤积的胆汁成分对肝细胞和胆管细胞的损伤。残黄片通过激活肝脏FXR、PXR的基因转录和提高FXR的表达,显著提升了UGT1A1和MRP2的表达,促进了未结合胆红素亲水解毒和排出肝脏。在回肠残黄片提高了FXR和MRP2的mRNA和蛋白的表达,促进胆汁成分的肠分泌排出。本研究解决了现有工艺中存在的青黛白矾混合不均匀和成品质量不稳定的问题,提升了残黄片质量稳定性,预测了其潜在活性成分和退黄作用靶点,比较了工艺优化前后残黄片退黄保肝作用,并从调节胆汁肝肠循环角度验证了分子对接预测的退黄作用靶点和机制。