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研究目的:通过小鼠C2C12成肌细胞体外培养和C57BL/6小鼠体内实验探究黄芪皂苷（Astragaloside,AST）对D-半乳糖（D-galactose,D-gal）诱导的骨骼肌细胞减少的作用及其作用机制。研究方法:实验一:体外细胞实验探究黄芪皂苷对D-半乳糖诱导的C2C12细胞减少的作用及其作用机制的研究1.细胞增殖-毒性检测:体外培养小鼠C2C12成肌细胞,使用96孔细胞培养板进行培养、增殖以及分化,通过细胞增殖-毒性检测（Cell counting kit-8,CCK-8检测）吸光度,探究AST是否对D-gal处理的C2C12成肌细胞具有促进增殖和分化的作用以及AST干预C2C12成肌细胞的适宜药物浓度范围。2.HE染色:使用24孔细胞培养板培养细胞,通过苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE染色法）对细胞进行染色,从细胞形态和细胞肌管融合度上观察不同浓度的AST对D-gal诱导的骨骼肌细胞减少模型的影响。3.免疫荧光染色:体外培养C2C12成肌细胞的细胞爬片,进行细胞免疫荧光标记实验,用Image J 1.48软件（National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA）分析分化指数,以肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）阳性细胞中细胞核的百分比表达各组细胞肌管融合情况。4.蛋白质印迹法检测:C2C12成肌细胞给予20mg/ml D-gal以及有无不同浓度的AST干预,使用6孔细胞培养板对细胞进行培养,提取细胞蛋白。通过蛋白质印迹法（Western Blot,WB）探究AST改善D-gal诱导的C2C12成肌细胞减少的分子机制。5.通路抑制剂实验:给予D-gal+AST实验组添加Akt抑制剂MK2206以及p-AMPK抑制剂Compound C,通过Western Blot检测验证AST对D-gal处理的成肌细胞的作用与Akt激活、AMPK磷酸化的相关性。6.Annexin V-FITC/PI染色:采用Annexin V-FITC/PI染色法,探究AST对D-gal处理的C2C12成肌细胞肌管凋亡的影响。实验二:体内动物实验探究黄芪皂苷对D-半乳糖诱导的小鼠原发性肌肉减少症的作用及其作用机制的研究选取24只平均重量约30g的三月龄C57BL/6雄性小鼠进行动物实验。将小鼠随机分为4组（n=6）,分别设置为生理盐水对照组,D-gal模型组,D-gal+AST低浓度（10mg/kg）治疗组,D-gal+AST高浓度（20mg/kg）治疗组。D-gal模型组、D-gal+AST低浓度（10mg/kg）治疗组、D-gal+AST高浓度（20mg/kg）治疗组以120mg/kg/天的剂量腹腔注射D-gal,诱导形成原发性骨骼肌减少模型,同时给予对照组小鼠注腹腔射相同体积的生理盐水,连续造模8周,造模效果以跑台试验、双能量X光吸收仪（dual energy x-ray absorptiometry,DXA）扫描数据作为依据参考。8周后给予D-gal+AST低浓度（10mg/kg）治疗组和D-gal+AST高浓度（20mg/kg）治疗组相应浓度的AST进行治疗,其他动物组给予相同体积的生理盐水,腹腔注射4周。共计干预12周后进行动物骨骼肌取材,分别取每只小鼠双侧后肢的胫骨前肌（tibialis anterior muscle,TA）、股四头肌和腓肠肌称量并记录每只小鼠总体重和每块骨骼肌组织湿重。将取出的一侧骨骼肌组织立即放入GD组织固定液中固定过夜,进行石蜡包埋,制作为5μm的组织切片,进行HE染色,在每个剖面图的上、下、左右、中间等随机视野图像拍摄,用Image J软件计算骨骼肌肌管阳性面积百分比。采用1:100-1:250稀释的p-Akt抗体和p-AMPK抗体进行免疫组化染色,Image J软件分析TA肌肉中相应蛋白的表达水平;另一侧的骨骼肌组织立即放入液氮中,-80℃冰箱保存,后期通过组织研磨进行组织蛋白提取并通过WB进行分子机制分析。研究结果:实验一:1.细胞增殖-毒性检测:C2C12成肌细胞给予20mg/ml D-gal,有无不同浓度的AST。CCK-8实验显示,与对照组相比,20mg/ml D-gal处理后的细胞吸光度显著降低;AST干预D-半乳糖处理的C2C12成肌细胞的细胞吸光度显著增加,且当AST为0.08mg/ml浓度时干预D-gal处理的C2C12成肌细胞后吸光度值最高,因此后续细胞实验的AST浓度均设置为0.08mg/ml。2.HE染色:显微镜下观察HE染色显示,与D-gal组相比,AST干预D-gal处理的C2C12成肌细胞肌管阳性面积增大,成肌细胞分化程度显著提高。3.免疫荧光染色:通过免疫荧光染色标记MHC因子,结果显示与D-gal组相比,AST显著增加了D-gal诱导的肌管阳性面积。4.蛋白质印迹法检测:WB结果显示,与对照相比,D-gal诱导的MHC、Myogenin及Myo D等肌肉特异性蛋白表达水平显著降低,Myostatin的表达则显著升高,而AST显著逆转了上述蛋白因子的表达水平,说明AST促进C2C12成肌细胞肌管合成。且与D-gal组相比,AST干预后显著提高了FOX3a的磷酸化水平并降低了Atrogin-1和MURF1的蛋白表达,说明AST可以减少C2C12成肌细胞蛋白质降解。同时,D-gal处理的成肌细胞降低了肌管中p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR、p-P70S6K/P70S6K和pFox O3a/Fox O3a的水平,而AST改善了这些蛋白的表达,说明AST促进C2C12成肌细胞蛋白质的合成。并且AST可上调AMPK、SIRT-1、PGC-1α表达水平,说明其可促进促进C2C12成肌细胞线粒体供能稳态。5.通路抑制剂实验:结果显示,与D-gal+AST组相比,添加Akt抑制剂MK2206干预C2C12肌管后,肌管分化指数降低,并在一定程度上降低了AST处理后肌管中pm TOR/m TOR、p-P70S6K/P70S6K、p-Fox O3a/Fox O3a表达的升高。在添加p-AMPK抑制剂Compound C干预后,与D-gal+AST组相比,AMPK磷酸化水平和SIRT1、PGC-1α等因子的表达均显著降低。6.Annexin V-FITC/PI染色:Annexin V-FITC/PI染色结果显示,与对照组相比,Dgal组细胞凋亡率显著升高,而AST降低了D-gal引起的细胞凋亡比例。同时,WB检测与成肌细胞凋亡相关基因（BAX、Caspase 3和Bcl-2）的表达,结果显示AST能抑制D-gal诱导的C2C12肌管中Bax、和cleaved-caspase-3表达,上调Bcl-2的表达,说明AST能改善D-gal诱导的C2C12肌管凋亡。实验二:DXA扫描结果显示,D-gal显著降低了小鼠的瘦组织比重（以瘦组织占总体重的百分比表示）,AST处理后小鼠的瘦组织比重显著增加。跑台实验结果显示D-gal组小鼠最佳跑步时间显著降低,AST治疗后小鼠最佳跑步时间有所提高,说明AST可以改善D-gal导致的骨骼肌耐力下降。小鼠TA的HE染色结果显示,D-gal模型组骨骼肌横截面积小于对照组,而AST能使D-gal模型组骨骼肌横截面积增大。Western blot结果显示,AST改善D-gal导致的MHC、Myogenin和Myo D表达水平下降,以及D-gal处理的小鼠骨骼肌组织中Akt、m TOR、S6K和Fox O3a的磷酸化水平降低,还降低了D-gal导致的Bax和cleaved caspase-3的升高。研究结论:1.黄芪皂苷对D-半乳糖诱导的C2C12成肌细胞减少具有抑制作用,并促进C2C12成肌细胞的增殖分化。2.黄芪皂苷通过PI3K/AKT信号通路调控蛋白质合成和降解,改善D-半乳糖诱导的原发性骨骼肌减少症。3.黄芪皂苷通过AMPK/SIRT-1/PGC-1α信号通路促进线粒体供能稳态,改善D-半乳糖诱导的原发性骨骼肌减少症。4.黄芪皂苷可改善D-gal诱导的C57BL/6肌少症小鼠模型的肌肉功能。