间充质干细胞恶性分化及对肺癌移植瘤生长和转移的影响

来源 :蚌埠医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:forsoother
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目的:研究hUCMSCs对肺癌移植瘤生长的影响及移植瘤组织中A549细胞上皮-间质转化(EMT,epithelial mesenchymal transition)相关基因及蛋白表达,进一步探讨hUCMSCs在肺癌生长及转移过程中的作用。  方法:  (1)原代hUCMSCs的提取与培养:通过组织贴壁法从新生儿脐带中分离出人脐带组织间充质干细胞,流式细胞术进行免疫表型鉴定。  (2)建立肺癌裸鼠移植瘤模型:将24只裸鼠随机分为4组,每组6只。A549细胞单独注射组,腋下接种5×106个A549细胞;hUCMSCs单独注射组,腋下接种5×106个hUCMSCs;A549细胞和正常人皮肤成纤维细胞(Skin fibroblasts, SKs)共同注射组,腋下接种5×106个A549细胞与5×106个SKs;hUCMSCs和A549细胞共注射组,腋下接种5×106个hUCMSCs与5×106个A549细胞。裸鼠置于SPF级条件内饲养,每周2次测裸鼠皮下移植瘤直径变化并观察皮下移植瘤变化。  (3)免疫组织化学Elivision法检测hUCMSCs单独注射组裸鼠皮下结节中CK、Vimentin蛋白的表达。  (4)分别使用TTF-1-FITC、CD73-PE标记A549细胞和hUCMSCs,流式细胞仪分选出各组皮下移植瘤组织中TTF-1-FITC标记的A549细胞。  (5)实时荧光定量PCR方法分别检测分选出的A549细胞的E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、twist mRNA表达。  (6)Western-blotting方法检测分选出的各组A549细胞中E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、twist蛋白表达。  结果:  (1)脐带沃顿胶组织贴壁培养15天左右可以看到脐带周围梭形细胞爬出,约20天左右细胞融合逐渐铺满25cm2的培养瓶。细胞传代至第3代时可以观察到细胞形态均一、旋涡状生长。所提取出的hUCMSCs细胞,表达基质细胞相关表面标记CD73、CD90、CD105;不表达单核细胞表面标记CD14、淋巴细胞表面标记CD19、造血干细胞表面标记CD34、人类白细胞共同抗原CD45及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR;  (2)hUCMSCs和A549细胞共注射组裸鼠皮下移植瘤生长速度明显快于A549细胞单独组与A549细胞和SKs细胞共注射组,从裸鼠饲养第18天开始,肿瘤体积生长出现统计学差异(p<0.05),且差异持续存在。至实验结束,肿瘤体积分别为:A549细胞单独注射组(86.6±38.40)mm3,hUCMSCs单独注射组(13.9±2.0)mm3, A549细胞+Sks共注射组(26.2±17.2)mm3,A549细胞+hUCMSCs共注射组(354.65±177.01)mm3。另外,hUCMSCs细胞单独注射组出现了恶性分化,并且在hUCMSCs与A549细胞共注射组中有2只裸鼠出现了肺癌肝脏转移;  (3)hUCMSCs自发分化后表达上皮(CK)和间质(Vimentin)标记物;  (4)分选出各组移植瘤组织中TTF-1-FITC标记的A549细胞和CD73-PE标记的hUCMSCs;  (5)和hUCMSCs共注射组的A549细胞上皮表型标志E-cadherin、β-catenin mRNA相对表达量分别为3.56±2.12和3.93±2.40高于A549细胞单独注射组(1.19±0.76和1.10±0.55)与Sks和A549细胞共注射组(1.20±0.88和0.91±0.51)(p<0.05),而间质表型特征分子N-cadherin、vimentin及EMT转录调控因子twist mRNA表达水平的差异均无统计学意义(p均>0.05);  (6)和hUCMSCs细胞共注射的A549细胞上皮表型标志β-catenin表达强度为(0.656±0.112)明显高于A549细胞单独注射组(0.557±0.215)与A549细胞和SKs共注射组(0.503±0.007)(p<0.01);和hUCMSCs共注射组的A549细胞E-cadherin表达强度为(0.793±0.127)明显高于A549细胞和Sks共注射组(0.573±0.010)(p<0.01),与A549细胞单独注射组相比无明显统计学意义(p>0.05)。和hUCMSCs共注射组的A549细胞间质表型特征分子N-cadherin、vimentin表达强度分别为(0.095±0.0190)和(0.265±0.005)明显低于A549细胞单独注射组(0.261±0.004和0.369±0.143)与A549细胞和Sks细胞共注射组(0.432±0.009和0.392±0.004)(p<0.01)。和hUCMSCs共注射组的A549细胞EMT转录调控因子twist蛋白表达为(0.258±0.002)低于A549细胞单独注射组(0.282±0.010)(p<0.05),明显低于Sks和A549细胞共注射组(0.439±0.005)(p<0.01)。  结论:  (1)hUCMSCs在裸鼠皮下发生了自我恶性分化;  (2)hUCMSCs在肺癌移植瘤生长过程中促进了移植瘤的生长与转移;  (3)hUCMSCs不是通过诱导A549细胞发生EMT(上皮-间质转化)增强A549细胞的转移能力。
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