目的：骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是细胞外基质中一种重要的功能性蛋白，可由多种组织细胞合成与分泌。近年来的研究表明，OPN作为机体反应性蛋白，在机体炎症、组织损伤与修复等病理过程中具有重要的功能和作用。在心血管系统中，OPN 通过与血管内皮和平滑肌细胞(VSMC)表面的整合素受体相互作用而介导细胞黏附和迁移，进而参与血管内皮损伤所导致的内膜增生的发生与发展过程。为了研究OPN诱导VSMC黏附和迁移的分子机制及其在血管内膜增生中的作用，制备OPN是必要的。为此，本实验利用基因重组技术，将OPN cDNA与携带GST 编码序列的原核表达载体进行重组后，在大肠杆菌中表达得到GST-OPN融合蛋白，为进一步研究该蛋白在血管内膜增生中的作用奠定了基础。 方法： 1、OPN原核表达质粒的构建 将OPN cDNA片段克隆入pGEX-4T-1原核表达载体，构建pGEX-4T-1-OPN质粒，经限制性内切酶图谱和DNA序列分析对重组质粒进行鉴定。 2、GST-OPN融合蛋白在大肠杆菌中的表达 2.1 GST-OPN融合蛋白的诱导表达 将pGEX-4T-1-OPN转化大肠杆菌后，对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化，确定GST-OPN融合蛋白诱导表达的最佳条件。在最佳条件下对pGEX-4T-1-OPN转化菌进行诱导培养后，将菌体裂解后离心，分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞中的存在形式。 2．2 GST-OPN融合蛋白的分离纯化 菌体经裂解及离心后取上清，用GST-Sepharose 4B亲和层析对GST-OPN融合蛋白进行纯化。 3、GST-OPN融合蛋白生物学活性检测 3．1细胞黏附实验 将传代的VSMC接种到用OPN包被的96孔板中，检测单位时间内黏附至孔板上的细胞数，以此表示细胞黏附活性。以从VSMC培养基中提取的天然OPN和GST蛋白作为平行对照，以确定GST-OPN促进细胞黏附的特异性。 3．2伤口愈合实验 细胞传代时，将VSMC接种于带有玻片的孔板内，细胞生长至100％汇合后，用无菌吸头在玻片上划痕。PBS洗净刮下的细胞，将玻片放回孔板内，每孔加入23 mg/LGST-OPN，继续孵育24 h后，于低倍镜下观察细胞伤口愈合程度，以此表示细胞的迁移活性。以从VSMC培养基中提取的天然OPN和GST蛋白作为平行对照，以确定GST-OPN促进细胞迁移的特异性。 结果： 1、重组质粒pGEX-4T-1-OPN的构建 以含有OPN cDNA序列的重组质粒OP10(DrLarryFisher惠赠)为模板进行PCR扩增得到的OPN cDNA片段与pGEX-4T-1载体连接得到重组表达质粒。重组质粒经Bam H I/Xho I双酶切后进行电泳鉴定时出现长度为860 bp左右的插入片段，与预期结果相一致。测序分析结果与GeneBank 收录的OPN cDNA序列进行比对，证明插入片段的序列是正确的。 2、GST-OPN融合蛋白的诱导表达 转化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌经IPTG诱导后可表达分子量约75 kD的蛋白质。在培养物OD<,600>=1.5时按1：50的比例接种于含0.1 mmol/IPTG的LB培养液中，25℃诱导培养6 h的条件下， GST-OPN融合蛋白的表达量在菌体蛋白中所占比例最大，融合蛋白主要以可溶性形式存在。此条件作为GST-OPN 融合蛋白诱导表达的最佳条件。 3、GST-OPN融合蛋白的分离纯化 转化pGEX-4T-1-OPN的宿主菌在最佳条件下被诱导培养后，离心收集菌体，用PBS(pH 7.3)重悬后加NaOH调pH值为8.0，以达到溶菌酶发挥作用的最适pH，用溶菌酶室温消化后加Triton X-100以防止蛋白交联。离心收集上清，加谷胱甘肽琼脂糖珠共孵育，经PBS洗涤4-5次后，用还原型谷胱甘肽洗脱液进行数次洗脱，合并收集的洗脱液。取适量洗脱液进行SDS-PAGE，结果可见清晰的单一的75 kD蛋白条带，说明经亲和层析纯化的GST-OPN 已达电泳纯。100 ml培养物经亲和层析纯化后，得到约3 mg可溶性GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白对VSMC黏附的影响 本研究观察重组GST-OPN融合蛋白对细胞黏附的影响。实验发现，GST-OPN融合蛋白能够显著促进VSMC的黏附，其作用与天然OPN相比无统计学差异。平行对照中的GST蛋白不影响VSMC的黏附。 5、GST-OPN融合蛋白对VSMC迁移的影响 VSMC迁移是由细胞与细胞外基质及多种细胞因子相互作用所介导的。细胞外基质中的OPN作为整合素的主要配体在VSMC迁移中发挥重要作用。本实验研究重组OPN对细胞迁移的影响，与黏附实验分组相同。结果发现，GST-OPN可明显促进细胞的迁移，其作用与天然OPN 相比无统计学差异，平行对照实验中的GST蛋白对VSMC的迁移没有影响。 结论： 1、成功构建了含有OPN基因序列的pGEX-4T-1-OPN原核表达质粒。 2、经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化，25℃条件下用0.1 mmol/L IPTG诱导6 h，GST-OPN融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。 3、菌体经裂解及离心后取上清，经GST-Sepharose 4B亲和层析得到电泳纯的GST-OPN融合蛋白。 4、GST-OPN融合蛋白能显著促进VSMC黏附。 5、GST-OPN融合蛋白能显著促进VSMC迁移。