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他克林是1995年至1996年期间美国食品和药物管理局批准用于治疗阿尔兹海默症的第一种药物。广西大学动物解剖实验室已有研究发现,他克林在猪精子液态保存和冷冻保存方面都有很好的抗凋亡效果。虾青素是一种天然类胡萝卜素,国内外对其抗炎症、抗氧化和增强免疫等药理作用进行了广泛研究,但在动物炎症方面的应用还没有深入的研究,故其在用于治疗动物疾病及替代抗生素功能上还有待研究与开发。本研究试图从体内、体外两个层面探索他克林、虾青素对小鼠睾丸支持细胞(Mouse testicular support cells,TM4)和小鼠睾丸的抗炎保护作用,进而助力高质量精子的产生及药物的推广应用。具体研究内容及结果如下:试验1.小鼠TM4细胞的培养及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导浓度探索。将小鼠TM4细胞系用含有5%马血清、2.5%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12细胞培养基中培养,观察细胞生长周期,并采用油红O特异染色法鉴定细胞纯度,采用CCK8及ELISA法检测LPS对TM4细胞损伤的程度。结果提示,TM4细胞培养4 h后出现贴壁;12 h后几乎全部贴壁,整体轮廓清晰并伴有触角;培养24 h之后,细胞已基本具备成熟细胞的轮廓伸出触角,呈不规则型且开始增殖;培养48 h之后,细胞之间相互连接形成网状,逐渐形成单层贴壁细胞。油红O染色细胞纯度>98%,其中LPS浓度为1μg/m L诱导处12 h更容易产生炎性损伤(P<0.05),且显著上调细胞培养上清炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达(P<0.05)。试验2.他克林、虾青素对LPS诱导损伤TM4细胞保护作用的评价。试验分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组)。取生长状态良好的对数期TM4细胞,以每孔1×10~4个细胞的密度接种于6 m L培养板中,空白组加DMEM/F12溶液3 m L,LPS组加含LPS(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Tac组细胞先诱导损伤后再加含他克林(0.01μg/m L、1μg/m L、100μg/m L、10000μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Asx组细胞先诱导损伤后再加含虾青素(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L。按试剂盒提取细胞总RNA与蛋白质进行荧光定量PCR与WB试验。结果显示,与空白组相比,LPS组显著上调IL-6、TNF-α的m RNA及NF-κB蛋白表达(P<0.05)。LPS+Tac组高、中浓度(10000、100、1μg/m L)组,上调NF-κB蛋白表达(P<0.05),低浓度组相比高、中浓度组显著降低NF-κB蛋白表达(P<0.05)。LPS+Asx组极显著下调IL-6、TNF-α的mRNA及NF-κB蛋白表达(P<0.01)。试验3.他克林、虾青素对LPS诱导的小鼠睾丸异常损伤保护作用的分析。选取24只5周龄正常雄性小鼠,分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组),每组6只。空白组每只注射200μL生理盐水。LPS组小鼠腹腔注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h;LPS+Tac组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.05 mg/kg他克林保护1.5 h;LPS+Asx组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.8 mg/kg虾青素保护6 h。解剖取出一侧睾丸制成石蜡切片,运用HE染色法观察组织病理形态,另一侧睾丸进行q RT-PCR和WB检测。鉴定结果提示,LPS诱导损伤模型成功,且0.05mg/kg他克林、0.8 mg/kg虾青素显著抑制LPS诱导的雄性小鼠睾丸异常损伤。与空白组相比,LPS组显著上调IL-6、TNF-α、HSP70的m RNA及TLR4、HSP70蛋白表达(P<0.05)。与LPS组比,LPS+Tac组与LPS+Asx组显著下调IL-6、TNF-α的m RNA表达(P<0.05),LPS+Tac组极显著下调TLR4、HSP70蛋白表达(P<0.01),LPS+Asx组极显著下调TLR4蛋白表达(P<0.01),显著上调HSP70蛋白表达(P<0.05)。总之,本研究从体内、体外两个层面来研究他克林、虾青素对TM4细胞和小鼠睾丸保护作用机制及最佳保护浓度,结果提示,0.01μg/m L他克林、1μg/m L虾青素能显著抑制LPS处理的体外培养的小鼠TM4细胞损伤以及0.05 mg/kg他克林、0.8 mg/kg虾青素能显著抑制体内小鼠睾丸的异常损伤。试验结果为推动他克林、虾青素在实际生产中对雄性动物生殖器官的抗炎保护机制和高质量精子的产生提供了一定的理论依据。